Agradecemos ao Dr. Canção Yijun, e membros da Kuruvilla Hattar Zhao tri-laboratório do Departamento de Biologia, da Universidade Johns Hopkins para aconselhamento e ajuda. Suportado pelo NIH concede DC007395 e DC009946.

Parte 1. A configuração de gravação EOG O aparelho de gravação consiste de um eletrodo de registro, eletrodo de referência, tubo de ar, estágio da amostra, e microscópio de dissecação, tudo ancorado em uma mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday. Micromanipuladores são usadas para a colocação dos eletrodos e do tubo de entrada de ar. A corrente de ar contínua é borbulhar na água destilada para adicionar umidade antes de passar através do tubo de vazão de ar e sobre a amostra. A placa de cultura 60 milímetros cheio de Sylgard a uma profundidade de 6-8 mm é usada como uma superfície de montagem para a amostra. Um bem e um canal são esvaziadas do Sylgard no prato de montagem para fornecer um meio para conectar eletricamente o eletrodo de referência com o modelo modificado através de solução de Ringer. O eletrodo de registro eo eletrodo de referência são conectados a um amplificador. Sinais do amplificador são enviados para um digitalizador e, em seguida, a um computador. Software, tais como Axograph ou pClamp pode ser usado para controlar o protocolo de estimulação, para gravar o sinal, e para posterior análise das respostas. Um osciloscópio conectado após o amplificador pode ser conveniente para monitoramento em tempo real do potencial elétrico ao colocar o eletrodo de gravação e durante as gravações EOG. Entrega de estímulos olfativos é controlado por um Picospritzer, que é conectado ao mesmo computador usado para a aquisição de sinal. A pressão do ar no Picospritzer está definido para 10 psi. Um único tanque de ar e regulador pode ser usado para suprimento de ar para o ar tanto tabela eo Picospritzer. Um segundo tanque de ar e regulador é usado para fornecer ar para a corrente de ar umidificado, pois isso requer uma pressão mais baixa e uma grande quantidade de fluxo de ar. Pouco antes de entregar um estímulo odorante, a saída Picospritzer está conectado a uma garrafa de odores. A garrafa odorant é então ligado ao tubo de ar. Parte 2: Preparando-se eletrodos O eletrodo de gravação é um fio de prata chlorided em um copo puxado capilar preenchido com solução de Ringer modificado (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4, esterilizado por filtração). O eletrodo de referência é um fio de prata chlorided. <ol><li> Instale fio de prata no porta-eletrodo. Para o eletrodo de registro, de um a dois centímetros de fio devem se projetar a partir do fim do suporte do eletrodo. Mais fio pode ser deixado para o eletrodo de referência. </li><li> Para adicionar o casaco AgCl para o fio de prata, a posição do fio em 0,1 M NaCl e ligue o suporte do eletrodo para o terminal positivo de uma fonte de energia 1,5-9 V DC. O terminal negativo da fonte de alimentação deve ser eletricamente conectados à solução de NaCl 0,1 M. Permitir que a reação chloriding para continuar por 10 minutos. Para equalizar a carga estática entre a gravação eo eletrodo de referência, brevemente os eletrodos juntos antes de instalá-los no aparelho de gravação. </li><li> Puxar um capilar de vidro usando um extrator micropipeta. A abertura na ponta do capilar deve ser em torno de 10/05 microns de diâmetro. </li><li> Use um lápis de diamante para marcar e quebrar o fim brusco do capilar por isso é ~ 2 cm maior do que o fio de prata. -Fogo polonês a extremidade cortada com a tocha butano. </li><li> Melt agarose 0,5% em solução de Ringer modificado. Puxe uma pequena quantidade de solução de agarose derretida na ponta do eletrodo usando uma pipeta. </li><li> Preencher o capilar puxado aproximadamente 1 / 2 do caminho com solução de Ringer modificado (uma seringa que foi aquecido e puxado para ter um final longo e fino é útil para esta finalidade). Agite suavemente o capilar para desalojar as bolhas de ar. Armazenar o eletrodo cheia no frasco de armazenamento com uma pequena quantidade de solução de Ringer modificado no fundo até que estejam prontos para serem usados. Uma vez que uma amostra de tecido é preparado e pronto para a gravação, instale um capilar preenchido ao longo do fio eletrodo de registro. </li></ol> Parte 3: Preparar soluções odorant O acetato de amila odores e heptaldehyde evocam respostas grandes e, assim, são escolhas boas como estimulantes EOG. <ol><li> Em tubos de microcentrífuga, preparar uma série de diluições de odores em dimetil sulfóxido (DMSO). Como ponto de partida para uma curva dose-resposta, prepare-10 diluições de 5 M para 5 x 10 -6 M. Fazer diluições fresco todos os dias. </li><li> Diluir ainda mais o odorants 50 vezes na água misturando 100 mL de ações diluídas em DMSO com 4,9 ml de água em duas garrafas com rolhas de silicone onça. Deixe as soluções equilibrar nas garrafas por pelo menos 30 minutos. Note que a concentração de vapor de odorante em cada garrafa é desconhecida, mas pode variar em função da concentração de odorante na fase líquida. </li><li> Coloque duas agulhas calibre 18, através da rolha de silicone para provide portas de entrada e de saída. As portas devem ser ligados quando a garrafa não estiver em uso. </li></ol> Parte 4: Gravação dos dados e análise de EOG <ol><li> Sacrificar um rato por CO 2 ou a eutanásia overdose anestésico seguido de decapitação. Retire a pele que cobre o crânio e sagital bisect a cabeça ao longo da linha média. </li><li> Monte uma metade da cabeça, lado medial para cima, sobre o prato de montagem. Remova cuidadosamente o septo para expor os cornetos. </li><li> Coloque o prato com tecido montada no palco de gravação. Alinhar o palco para que o local de gravação na cornetos está centrada sob o microscópio. </li><li> Ligue o tanque de ar para fornecer ar umidificado à superfície da concha. Posicione o tubo de ar de modo que é de aproximadamente 10 mm de distância do local de gravação. A vazão é de aproximadamente 600 mL / min. </li><li> Definir o amplificador para o modo DC (amplificação AC irá induzir artefatos no sinal de EOG) com filtro passa-baixa a 1 kHz, e ganho em 100X. </li><li> Montagem de gravação e eletrodos de referência na micromanipuladores. </li><li> Inferior o eletrodo de referência dentro do poço sobre o prato de montagem e cobrir com solução de tal forma que é eletricamente conectada ao tecido modificado Ringer. </li><li> Cuidadosamente abaixe o eletrodo de registro na superfície do corneto IIb ou III. O eletrodo mal deve tocar a superfície do epitélio olfativo! Quando o eletrodo entra em contato com o epitélio (isto é, completa um circuito elétrico) uma linha de base reta aparecerá no osciloscópio. </li><li> Anexar uma garrafa odorant à porta lateral do tubo de ar. </li><li> No computador, iniciar um protocolo de estimulação. A taxa de amostragem para aquisição de dados deve ser de 2 kHz ou superior. O software irá desencadear um impulso de odor e começar a gravar. </li><li> Um protocolo de estimulação típico pode ser de 100 ms duração do pulso único, emparelhado 100-msec pulsos separados por um intervalo de 1 seg, ou a 10 seg de pulso sustentado. </li><li> Dar algum tempo entre os protocolos de modo que o tecido é minimamente adaptadas. Um minuto é suficiente para as concentrações de líquido de acetato de amilo e heptaldehyde até 10 M -3; em concentrações mais elevadas permitem que 5 minutos. Depois de entregar as concentrações de odor alta (como no final de uma curva dose-resposta) odor residual pode permanecer no tubo. Lave o tubo de ar com 95% de etanol e seco antes de continuar com amostras de tecido adicional. </li><li> Axograph software oferece ferramentas para medir os parâmetros-chave do sinal de EOG. Tais parâmetros incluem a amplitude de resposta, latência, tempo de pico, e constantes de tempo da rescisão. Pode ser desejável para digitalmente filtro de traços a 25 Hz antes de uma análise mais aprofundada. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Parâmetros para EOG análise. Vários parâmetros do EOG são particularmente úteis para a comparação de respostas entre os ratos, incluindo a amplitude da resposta, a latência (o tempo entre quando o estímulo é administrado ea resposta começa), aumento do tempo (o tempo entre o início da resposta eo pico), tempo de pico (o tempo desde o início do estímulo até o pico da resposta), e constante de tempo de terminação (τ, determinado pelo ajuste a fase de decadência da resposta a uma única equação exponencial ). Para a comparação dos parâmetros cinéticos, tais como latência, tempo de subida, e constante de tempo de terminação, é aconselhável para normalizar a amplitude do pico das respostas antes da análise. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Representante EOG sinais em diferentes protocolos de estimulação. (A) Exemplos de EOGs de um camundongo em resposta à estimulação com concentrações crescentes de acetato de amila. A linha preta na parte superior do painel indica o momento ea duração do estímulo odorante. As concentrações na legenda são as concentrações da solução líquida. (B) A relação dose-resposta em média de cinco camundongos. Barras de erro são os intervalos de confiança de 95%. Um declínio na amplitude de pico é freqüentemente observado em concentrações odor muito alto. (C) Um exemplo de um EOG em resposta a um estímulo emparelhado pulso. Um único pulso curto de odorant provoca adaptação com duração de vários segundos. (D) Um exemplo de um EOG em resposta a uma de 10 seg sustentada estímulo odorante. O EOG dessensibilização mostra durante a apresentação odorant contínua.

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	<li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium.">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, 1-83 (1956).</li><li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroolfactogram:+a+review+of+its+history+and+uses.">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li><li>Brunet, L. J., Gold, G. 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Camundongos foram tratados e sacrificados com os métodos aprovados pelo Animal Care e Comitês Uso do The Johns Hopkins University.

Com a configuração descrita neste protocolo, os estímulos olfativos na superfície do epitélio olfativo será consistente entre preparações de tecido, permitindo a comparação entre o tipo selvagem e ratos mutantes, embora a concentração de odores e dinâmica exata é desconhecida. Vários fatores, especialmente a localização de gravação ea taxa de fluxo de ar umidificado, causam variações na EOG. Cuidados devem ser tomados para gravar a partir de posições semelhantes sobre o corneto mesmo para minimizar a variação. Isto pode ser facilmente alcançado de forma consistente a gravação do mesmo lado da cabeça e manter a pegada do microscópio, tubo de odor, e micromanipuladores sobre a mesa de ar inalterada entre amostras de tecido. Além disso, amostras de tecido deve ser colocado imediatamente no fluxo de ar umidificado após a dissecção para evitar a secagem excessiva do tecido. EOG gravações em ratos também podem ser realizadas com um aparelho de perfusão de líquido no mouse preparado cornetos 7, 14, 15, ou deixando a cabeça intacta e inserindo o eletrodo em um pequeno buraco perfurado acima dos cornetos 16, 17. Cada variação de gravação EOG tem suas próprias forças: ar-fase gravações em preparações de tecido, conforme descrito neste protocolo requer uma quantidade mínima de instalação e são mais fáceis de conduta; gravações usando um aparelho de perfusão de líquidos facilitar o uso de reagentes farmacológicas, embora o natureza hidrofóbica de odores muitas complica entrega odor, por último, as gravações em que o chefe é deixada intacta pode ser usado em &#39;artificial sniff&#39; experimentos, embora a colocação do eletrodo é mais difícil do que quando os cornetos estão totalmente expostos.

<table><tbody><tr><td>Air delivery tube</td><td>equipment</td><td>Custom Made</td><td></td><td>The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute</td></tr><tr><td>Air table</td><td>equipment</td><td>Newport Corp.</td><td>LW3030B-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>equipment</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-301</td><td></td></tr><tr><td>Computer and Data Acquisition Software</td><td>equipment</td><td>Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh</td><td></td><td>Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.</td></tr><tr><td>Butane torch</td><td>equipment</td><td></td><td></td><td>A cr&amp;#232;me br&amp;#251;l&amp;#232;e torch works well</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>equipment</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>equipment</td><td>Scienscope</td><td>SSZ</td><td></td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>equipment</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1021</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Holding Devices (12 mm)</td><td>equipment</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>equipment</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>equipment</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>equipment</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>equipment</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing</td><td>equipment</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Specimen stage</td><td>equipment</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.</td></tr><tr><td>18 gage needles</td><td>material</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>2 oz. glass bottles</td><td>material</td><td>VWR international</td><td>16152-201</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>material</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Silicone stoppers size 16D</td><td>material</td><td>Chemware</td><td>D1069809</td><td></td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>material</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>SylGuard 184</td><td>material</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>From World Precision Instruments</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Amyl acetate</td><td>reagent</td><td>Aldrich</td><td>W504009</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Heptaldehyde</td><td>reagent</td><td>Aldrich</td><td>H2120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>reagent</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>flowmeter</td><td>equipment</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GF-2260</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording

Animais dependem do olfato para muitos comportamentos críticos, tais como encontrar fontes de alimentos, evitar predadores, ea identificação de membros da mesma espécie para acasalamento e outras interações sociais. O electroolfactogram gravação (EOG) é um método informativo, fácil de conduzir, e de confiança para a função teste olfativo no nível do epitélio olfativo. Desde a descrição de 1956 do EOG por Ottoson em rãs 1, a gravação EOG tem sido aplicado em muitos vertebrados, incluindo salamandras, coelhos, ratos, camundongos e humanos (revisado por Scott e Scott-Johnson, 2002, ref. 2). Os recentes avanços na modificação genética em camundongos reacenderam o interesse pela gravação do EOG para a caracterização fisiológica da função olfativa em knock-out e knock-em camundongos. EOG gravações têm sido aplicados com sucesso para demonstrar o papel central das componentes de sinal olfativo de transdução de 3-8, e mais recentemente para caracterizar a contribuição de certos mecanismos de regulação de respostas OSN 12/09. Detecção de odores ocorre na superfície do epitélio olfativo sobre os cílios de ORS, onde uma cascata de transdução de sinal leva à abertura de canais iônicos, gerando uma corrente que flui para os cílios e despolariza a membrana 13. O EOG é o potencial negativo registrado extracelularmente na superfície do epitélio olfativo com a estimulação odorant, resultante de um somatório das mudanças potenciais causados ​​pela individuais ORS resposta no campo de gravação 2. Comparação da amplitude e da cinética do EOG, assim, fornecer informações valiosas sobre como modificação genética e outras manipulações experimentais influenciam a sinalização molecular subjacente a resposta à OSN odor. Aqui nós descrevemos uma gravação EOG ar-fase em uma preparação de cornetos rato olfativo. Resumidamente, depois de sacrificar o rato, o cornetos olfativos são expostos por bisecting a cabeça ao longo da linha média e remoção do septo. A preparação concha é então colocada na configuração de gravação, e um eletrodo de gravação é colocado na superfície do epitélio olfativo em uma das conchas nasais medial. Um eletrodo de referência é eletricamente conectada ao tecido através de uma solução tampão. Um fluxo contínuo de ar umidificado é soprado sobre a superfície do epitélio para mantê-lo úmido. O vapor de soluções odorant é soprado para a corrente de ar umidificado para estimular o epitélio. Respostas são gravadas e digitalizadas para posterior análise.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K visualizações.  Johns Hopkins University. O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Multieletrodo Recordings Matriz do Epitélio Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Neurociência

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Medidas eletrofisiológicas partir de um sistema olfativo Traça

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts

Recent studies have shown that ocean acidification affects olfactory-driven behavior in fish. This may be due in part to a reduction in olfactory sensitivity in high PCO2/low pH water. To assess the effects of ocean acidification, or olfactory sensitivity in marine fish in general, we propose that extracellular multi-unit recording from the olfactory nerve is the method of choice. Although invasive, it is sensitive, robust, reproducible and independent of external salinity (unlike the electro-olfactogram [EOG], for example). Furthermore, it records a primary sensory input into the CNS, prior to any central processing. We show that this method can show a reduction in olfactory sensitivity that is both temporary and odorant-dependent, using a range of amino acids to construct concentration-response curves and calculate the thresholds of detection.

Extracellular multi-unit recording from the olfactory nerve is a sensitive, robust and reproducible method for assessing olfactory sensitivity in marine fish. It records primary sensory input and is independent of external salinity.

Gravação multi-unitular extracelular do nervo olfativo dos teleóstos

Recent studies have shown that ocean acidification affects olfactory-driven behavior in fish. This may be due in part to a reduction in olfactory ...

Ambiente

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, oviposition, and mating. Myriad chemicals of varying volatilities have been identified as natural odorants that activate insect Olfactory Receptor Neurons (ORNs). However, studying the olfactory responses to low-volatility odorants has been hampered by an inability to effectively present such stimuli using conventional odor-delivery methods. Here, we describe a procedure that permits the effective presentation of low-volatility odorants for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). By minimizing the distance between the odor source and the target tissue, this method allows for the application of biologically salient but hitherto inaccessible odorants, including palmitoleic acid, a stimulatory pheromone with a demonstrated effect on ORNs involved in courtship and mating behavior1. Our procedure thus affords a new avenue to assay a host of low-volatility odorants for the study of insect olfaction and pheromone communication.

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

The overall goal of this protocol is to demonstrate how to present odorants of low volatility for single-sensillum recording from Drosophila olfactory receptor neurons that respond to long-chain cuticular pheromones.

Gravação eletrofisiológica de<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensilla Tricoide em resposta aos odorantes de baixa volatilidade

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Perforated Patch-Clamp Recording of Olfactory Sensory Neurons in Mice

Source: Jarriault, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52652">Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates electrophysiological recording of olfactory sensory neurons (OSNs) in mice using a perforated patch-clamp technique. The olfactory epithelium, containing OSNs with fluorophore-tagged odor receptors, is isolated from a mouse and secured in a recording chamber. A recording pipette is clamped to the dendritic knob of an OSN, and nystatin within the pipette perforates the membrane to form electrical connectivity with the cell. Finally, another pipette is used to deliver an odor stimulant, and the electrophysiological activity of the patched cell is recorded.

Registro perfurado de neurônios sensoriais olfativos em camundongos

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

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