Agradecemos a Shao-Ming Lu e Harris A. Gelbard para o uso de uma bomba peristáltica e vibratome, bem como Karen L. Bentley e Gayle Schneider no Electron Microscope Facility Núcleo de Pesquisa da Universidade de Rochester Medical Center para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (EY019277), Fundação Whitehall, Burroughs Wellcome Fund, e Alfred P. Sloan Foundation para AKM. M.-È.T. é financiado por um de Fonds la recherche en santé du Québec (FRSQ) prêmio de treinamento pós-doutorado.

1. Perfusão animais <ol><li> No dia antes da perfusão, prepare: - 2 L de tampão fosfato (PB; 100 mM, pH 7,4) e 1 L de sódio tampão fosfato (PBS, 0,9% NaCl em 50 mM PB, pH 7,4) em água destilada duas vezes. Armazenar o PBS e 1L de PB a 4 ° C. Estes serão usados ​​para a perfusão e incorporação de pré-imunocitoquímica. - Solução de 1L de paraformaldeído 4,0% (PFA, pH 7,4) fixador, o que permitirá a perfusão de 6 camundongos. Para o efeito, aquecer 1 L de PB sob uma coifa. Pesar 40 g de paraformaldeído granular (PFA) e despeje na solução PB quando atinge 60 ° C. Quando a solução é clara, com o PFA completamente dissolvido, arrefecer à temperatura ambiente (RT) e armazenar a 4 ° C. </li><li> No dia da perfusão, preparar 500 mL de solução de acroleína 3,5% em PB sob uma coifa. Então, filtrar a acroleína 3,5% e 4,0% PFA soluções utilizando papel de filtro. </li><li> Para anestesia mouse, injetar pentobarbital sódico (80 mg / kg) para o peritônio com uma calibre 27 ½ &quot;agulha. </li><li> Durante a perfusão, 50 mL de PBS, 75 ml de acroleína, e 150 mL de PFA serão seqüencialmente passam para a circulação mouse. Para configurar a bomba peristáltica, encha o tubo com PBS e fixar um calibre 23 ¾ &quot;agulha borboleta em uma extremidade. Mergulhe a outra extremidade do tubo na solução de perfusão (PBS, acroleína ou PFA). Definir a velocidade da peristáltica bomba para 20-25 mL / min para os ratos jovens e adultos. Durante a perfusão, evitar cuidadosamente as bolhas de ar que formam na tubulação. </li><li> Espere até que o rato anestesiado não responde mais a estímulos dolorosos, como uma pitada de cauda, ​​antes de prosseguir. Coloque o animal em uma bandeja de dissecação e corrigir as patas com fita. Com uma pinça e tesouras, abrir a pele e cavidade torácica para expor o coração. Para minimizar a isquemia cerebral, a perfusão deve ser iniciada rapidamente. Corte aberto o átrio direito com uma tesoura pequena e iniciar a bomba peristáltica. Enquanto mantém o coração com uma pinça, insira a agulha borboleta no ápice do ventrículo esquerdo. </li><li> Ao mudar solução, parar a bomba peristáltica, a transferência da tubulação de uma solução para outra, e reiniciar a bomba imediatamente. </li><li> Quando 150 mL de PFA passou, parar a bomba peristáltica. Com uma tesoura pequena, corte a cabeça, abrir a pele e quebrar o crânio entre os olhos. Usando uma pinça pequena, com cuidado pegue pequenos pedaços de crânio até o cérebro pode ser facilmente removido. Pós-fix o cérebro por 2 horas a 4 ° C em PFA. Lavar 3 vezes 10 minutos em PBS. </li><li> Imediatamente cortar o cérebro em transversal (50 seções mm de espessura) em ice-cooled PBS usando um vibratome. Com um pincel fino, a transferência de seções selecionadas para imunocitoquímica em um frasco de vidro contendo PBS. Armazenar os restantes secções a -20 ° C em crioprotetor (30% de etileno glicol e glicerol 30% em PBS) por até vários anos. </li></ol> 2. Pré-incorporação imunocitoquímica <ol><li> Para imunocitoquímica, as seções são processados ​​livremente flutuando em frascos de vidro. Durante todo o processo, é preciso evitar cuidadosamente deixando seções secar. </li><li> Primeiro, remova a PBS usando uma pipeta de transferência e substituir imediatamente com uma nova solução de borohidreto de sódio a 0,1% em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe seções com PBS três vezes 10 minutos, retirando todas as bolhas, e incubar por 2 horas em temperatura ambiente em uma solução de bloqueio de PBS contendo 0,5% de gelatina e 5% de soro normal do animal em que o anticorpo secundário foi gerado (soro de cabra normal em presente exemplo da imunocoloração por Iba1). </li><li> Incubar durante 48 horas com o anticorpo primário em solução de bloqueio. Para Iba1 imunomarcação, utilize o anticorpo de coelho anti-Iba1 (1:1000). </li><li> Enxágüe seções com PBS três vezes 10 minutos e incubar em anticorpo secundário conjugado com biotina (1:1000) em solução de bloqueio por 2 horas em temperatura ambiente. Para Iba1 imunocoloração, use cabra anti-coelho IgGs. </li><li> Enxágüe seções com PBS três vezes 10 minutos e incubar em estreptavidina-peroxidase (1:1000) em solução de bloqueio por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe seções com PBS 10 minutos e com Tris / HCl-buffered saline (TBS, 50 mM, pH 7,4) duas vezes 10 minutos. Para revelar a rotulagem, incubar seções com DAB 0,05% e peróxido de hidrogênio 0,01% em TBS (solução recentemente preparada). Quando a coloração é marrom-escuro (veja o exemplo na Figura 1), parar a reação por lavagem em TBS. Em qualquer caso, a reação final após um máximo de 5 minutos. Enxágüe seções com TBS 10 minutos e com PB 2 vezes de 10 minutos. </li></ol> 3. Processamento para microscopia eletrônica <ol><li> Transferência de seções em PB em uma placa de cultura com vários poços usando um pincel fino. Prepare a solução de tetróxido de ósmio 1% em PB sob um capuz fumegante. Remover PB dos poços da placa de cultura e<html> difundir as seções planas com um pincel fino. Seções mergulhadas imediatamente em ósmio 1% por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Transferir as seções em frascos de vidro, lave com PB 3 vezes 10 minutos, e desidratar até 2 minutos para imersões ascendente concentrações de etanol: 2 vezes 35%, 1 vez cada um dos 50%, 70%, 80%, 90%, e 95 %, 3 vezes 100%, seguido por três vezes óxido de propileno. </li><li> Para preparar a resina Durcupan, combine 20 g do componente A, 20 g do componente B, 0,6 g do componente C e 0,4 g do componente D em um copo descartável, misture bem até que a cor se torna uniforme, e despeje em uma lata de alumínio pesam prato. Se necessário, blocos de resina podem ser preparados por vazamento de resina em moldes de incorporação e cura em um forno de 55 ° C durante 48-72 horas. </li><li> Usando um pincel fino lavado com óxido de propileno, remova as seções do óxido de propileno e mergulhe na resina Durcupan para impregnação durante a noite a RT. </li><li> No dia seguinte, coloque o prato de alumínio pesam em um forno de 55 ° C por 10 minutos para amolecer a resina. Usando uma escova lavados com óxido de propileno, um filme de revestimento incorporando Aclar com uma fina camada de resina, estabelecer as seções, cubra com outro filme de incorporação, e distribuir pesos leves (cerca de 2 g, por exemplo as tampas de plástico de frascos de vidro) em cima para ajudar a espalhar a resina. Para polimerização da resina, incubar no forno por 48-72 horas (a 55 ° C). </li><li> Após a polimerização, remover os pesos leves e incorporação de filme no topo das seções. Sob um microscópio binocular, selecionar áreas de interesse quadrados (cerca de milímetro 2x2) e com cuidado especial sobre o consumo-los do filme usando uma lâmina de barbear. </li><li> Cole as áreas de interesse na ponta de blocos de resina usando Superglue e cura no forno 55 ° C por 1 hora. </li><li> Em preparação para corte, cortar o bloco de resina com a forma de um trapézio isósceles com uma lâmina de barbear. </li><li> Utilizando um ultramicrótomo e uma faca de vidro, remover a cola e resina na superfície do tecido. Preencha o barco da faca de vidro com água bidestilada e cortar alguns semi-finos (0,5-1 mm de espessura). </li><li> Transferir as seções para um slide SuperFrost com um laço perfeito. Seca das seções, colocando o slide em uma placa de aquecimento a 80 ° C por 1 minuto. Cubra com algumas gotas de 0,1% mancha azul de toluidina (2 g de borato de sódio e 0,2 g azul de toluidina em 200 mL de água bidestilada) por 1 minuto. Lavar o excesso de corante com água destilada duas vezes. Exame das seções com um microscópio de luz permitirá distinguir o tecido manchado a partir da resina (Figura 2). </li><li> Retomar o corte até a fronteira entre o tecido e resina alcança o meio das seções. Note que o procedimento a seguir exige treinamento. Substituir a faca de vidro com uma faca de diamante e preencha o barco com água destilada duas vezes. Prata para cortar seções prata-ouro ultrafinos (60-80 nm de espessura) e cuidadosamente coletá-los em grades de cobre de malha fina usando uma pinça invertida. Seca das grades em um papel de filtro. </li><li> Para melhorar o contraste, as seções ultrafinas podem ser marcadas com citrato de chumbo (0,03 g citrato de chumbo e 0,1 mL de hidróxido de sódio 10N em 10 mL de água bidestilada 1). Usando uma pinça fina invertida, a transferência de uma grade para uma gota de citrato de chumbo por 2 minutos. Retire a grelha e delicadamente enxágüe em três banhos sucessivos de água destilada duas vezes. Por fim, seque as grades de um filtro de papel e guarde-os em uma caixa de grade, até o exame microscópico de elétrons (Figuras 3-6). </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Iba1 manchada de secção no nível de luz microscópica. A distribuição celular de Iba1 é restrito a microglia, que mostra a especificidade da imunomarcação. Barra de escala = 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Toluidina azul manchado de seção semi-fina no nível de luz microscópica. Nota da fronteira entre o tecido e resina onde a imunomarcação aparecerá mais intensa no microscópio eletrônico. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ultrafinos seção mostrando Iba1-imunopositivas pericário microglial e processos ao nível da microscopia eletrônica. Iba1 positivo elementos estruturais são reconhecidos por sua imunoperoxidase-DAB precipitar elétron-denso. Barra de escala = 2 m. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ultrafinos seção exibindo Iba1-imunopositivas processos microglial de tamanhos e formas diferentes ao nível da microscopia eletrônica. Barra de escala = 2 m. e 5 &quot;/&gt; Figura 5. Ultrafinos secção que mostra a maior ampliação de um processo Iba1 positivo microglial na Figura 4, permitindo a identificação de suas organelas intracelulares. Barra de escala = 1 mícron. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Secção ultrafinos revelando a maior ampliação das relações entre um processo ultra-Iba1 positivo microglial e elementos próximos de neuropil incluindo sinapses. Barra de escala = 1 Hm.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação do tecido cerebral do rato para imunomicroscopia que oferece um excelente compromisso entre a preservação ultraestrutural e detecção imunocitoquímica ideal, quando os procedimentos são rigorosamente executado. Combinado com o TEM, este método permite distinguir elementos celulares com poucas características e critérios de identificação. Em particular, a coloração de imunoperoxidase DAB-de Iba1 permite identificar perikarya m...

* Deve-se sempre trabalhar sob um exaustor e usar luvas ao manusear nitrilo acroleína, paraformaldeído, e ósmio e também deve dispor de seus resíduos de forma adequada.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é extremamente útil para visualizar microglial, oligodendrocytic, astrocíticos e neuronal compartimentos subcelulares (dendrito, espinha dendrítica, axônio, axônio terminal, pericário), bem como suas organelas e do citoesqueleto intracelular no sistema nervoso central em alta resolução espacial. Combinado com o TEM, pré-incorporação imunocitoquímica permite a discriminação de elementos celulares com poucas características e critérios de identificação (por exemplo, microglial perikarya e processos, quando se utiliza um anticorpo contra o marcador microglia específicos Iba1 (cálcio ionizado molécula adaptador de ligação 1; como apresentado aqui)), identificando o conteúdo do neurotransmissor dos elementos celulares (por exemplo, serotoninérgicos) e sua localização ultra-estrutural de proteínas solúveis ou ligada à membrana (por exemplo, 5 HT1A e EphA4 receptores). Aqui, nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de camundongos com acroleína fixador, remoção e corte do cérebro, bem como imunoperoxidase diaminobenzidina-coloração (DAB), a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame com TEM. Quando rigorosamente realizada, esta técnica fornece um excelente compromisso entre a preservação ultraestrutural e detecção imunocitoquímica ideal.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de ratos, remoção e corte do cérebro, bem como coloração por imunoperoxidase, a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame em microscopia eletrônica de transmissão.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.8K visualizações.  University of Rochester. Nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de ratos, remoção e corte do cérebro, bem como coloração por imunoperoxidase, a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame em microscopia eletrônica de transmissão.

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Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Neurociência

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Imunostaining flutuante livre de cérebros de rato

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Microscopic Imaging of Neurons in a Mouse Brain Section Using Golgi-Cox Metallic Staining

<a href='https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55358/imaging-neurons-within-thick-brain-sections-using-the-golgi-cox-method'>Source: Louth, E. L.,&#160; et al. Imaging neurons within thick brain sections using the Golgi-Cox method. J. Vis. Exp. (2017)</a>This video demonstrates imaging neurons in a Golgi-Cox stained thick brain section by setting upper and lower focus boundaries and capturing overlapping images. Multiple locations are imaged to ensure detailed neuronal projections, which are combined to create a 3D representation.

Source: Louth, E. L.,&#160; et al. Imaging neurons within thick brain sections using the Golgi-Cox method. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

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Advanced Microscopy & Imaging Technologies

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

<a href='https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53853/combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to'>Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)</a>This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica is mounted on a grid and visualized under an electron microscope.

Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate ...

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Immunohistochemistry of Mouse Brain Tissue Sections for Targeting Dopamine Neurons

<a href='https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52336/laser-capture-microdissection-demonstration-isolation-individual'>Source: Kummari, E., et. al., Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area., J. Vis. Exp. (2015)</a>In this video, we demonstrate the immunohistochemistry protocol for dopamine neurons in brain tissue sections for subsequent laser capture microdissection.

Source: Kummari, E., et. al., Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral ...