Entrega e expressão gênica aprimoradas usando injeção intraóssea de nanopartículas de quitosana encapsuladas em plasmídeos editores de base de adenina

Aqui, apresentamos uma abordagem de terapia gênica que fornece quitosana revestida com ABE diretamente na medula óssea por injeção intraóssea.

A entrega de plasmídeos exógenos em animais experimentais é crucial na pesquisa biomédica, incluindo a investigação das funções dos genes, a elucidação dos mecanismos da doença e a avaliação da eficácia do medicamento. No entanto, a eficiência de transfecção do método atual é relativamente baixa, e a introdução de plasmídeos para expressão gênica de longo prazo pode ser afetada pelo sistema imunológico. Para resolver essas limitações, desenvolvemos e investigamos um novo método que utiliza quitosana para encapsular plasmídeos editores de bases de adenina (ABE) e, em seguida, entregar diretamente o complexo à medula óssea de camundongos por injeção intraóssea. Neste estudo, para atingir o gene CaMK II δ , que está intimamente relacionado à diferenciação de osteoclastos, utilizamos quitosana para encapsular plasmídeos de δ ABE CaMK II . Injetamos diretamente a carga de plasmídeo na cavidade da medula óssea por injeção intraóssea. Os resultados mostraram uma alta eficiência de edição in vivo de 14,27% no locus A1 e 10,69% no locus A2 em camundongos receptores. Essa nova estratégia não é apenas particularmente adequada para doenças causadas pela função anormal dos osteoclastos, mas também possui um potencial significativo para o avanço do campo da terapia genética.

A terapia gênica tem emergido como uma abordagem promissora no campo da pesquisa biomédica ^1,2. Ele oferece o potencial de tratar uma variedade de distúrbios, introduzindo plasmídeos estranhos em animais experimentais para modular a expressão de genes específicos e estudar seus efeitos terapêuticos. No entanto, os métodos convencionais de entrega encontraram alguns problemas que limitam sua eficácia e segurança³. As preocupações incluem baixa eficiência de transfecção, alto dano biológico e baixa eficiência de expressão gênica. Portanto, é necessário estabelecer um novo método de entrega para terapia gênica que possa superar essas limitações.

A quitosana é um polissacarídeo natural com boa biodegradabilidade e biocompatibilidade ^4,5,6, o que facilita sua degradação no corpo dos animais sem causar toxicidade biológica grave. Tem sido amplamente utilizado na administração de medicamentos devido à sua alta taxa de incorporação de medicamentos ^7,8, maior eficiência de entrega e danos reduzidos aos animais.

A tecnologia de edição de genes ABE, que permite a conversão direta de pares de bases de A-T em G-C, é promissora em pesquisas genéticas e médicas. Em comparação com a atual tecnologia de edição de genes convencional, a tecnologia ABE pode alcançar mutação de base única precisa, reduzindo assim a edição de sequências de DNA não-alvo, reduzindo os efeitos fora do alvo ^9,10 e levando a zero quebras de fita dupla de DNA¹¹, o que reduz muito o risco de edição de genes¹². A tecnologia ABE também é altamente biocompatível e é mais adequada para pesquisas de tratamento de doenças.

A injeção na veia da cauda é um método comum usado para entrega in vivo de plasmídeos, especialmente em terapia gênica. O gene alvo para este estudo é o CaMK II δ, que está intimamente relacionado à diferenciação dos osteoclastos^13,14. O uso de injeção intraóssea em vez da veia da cauda permite que o plasmídeo editado entre nos osteoclastos diretamente na medula óssea. Essa transmissão direta para a medula óssea aumenta a eficiência e a estabilidade da expressão gênica, o que é vantajoso para o tratamento de doenças relacionadas à disfunção dos osteoclastos.

Aqui, apresentamos um novo método que envolve encapsular o plasmídeo ABE com quitosana e, em seguida, introduzir diretamente o complexo em camundongos por injeção intraóssea. Por meio desse método, esperamos abrir caminho para tratamentos de terapia gênica mais eficazes para plasmídeos estranhos que entram em organismos, especialmente doenças relacionadas à disfunção dos osteoclastos.

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Saúde Animal da Universidade de Anhui sobre o Uso e Cuidado de Animais. Neste estudo, a ABE foi generosamente doada pelo Professor Tian Chi (Universidade de Ciência e Tecnologia de Xangai, Xangai, China; Figura 1D).

1. Construção do plasmídeo ABE

1. Projete gRNA com a sequência TCCATGATGCACAGACAGGA onde o PAM é apresentado pelo GAC.
2. De acordo com o guia da lista de primers da empresa, adicione o primer ao volume correspondente de ddH₂O para atingir uma concentração de 100 μM. Em seguida, agite e misture bem para garantir uma distribuição uniforme. Para a reação de recozimento, prepare uma solução de 10 μM adicionando 10 μL da solução de primer de estoque ao novo tubo de microcentrífuga, 90 μL de ddH₂O, e misture bem.
3. Adicione 5 μL de primer a montante, 5 μL de primer a jusante e 40 μL de ddH₂O em um tubo de microcentrífuga. Para facilitar a reação de recozimento, mergulhe o tubo em um recipiente cheio de água fervente por 5 min. Certifique-se de que o nível da água não atinja a abertura do tubo para evitar que a água entre e contamine os primers. Resfrie até a temperatura ambiente para completar a reação de recozimento.
4. Adicione 2 μg de pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP (Figura 1D), 1 μL de ESP3I, 4 μL de tampão e 33 μL de ddH₂O em um tubo de microcentrífuga e deixe reagir em banho-maria de temperatura constante a 37 ° C por 45 min.
5. Realize eletroforese em gel de agarose. Prepare um gel de agarose a 1% pesando 0,5 g de agarose e despeje-o em um frasco de vidro. Adicione 50 mL de 1x tampão TAE no frasco de vidro e agite para dissolver o pó de agarose. Aqueça no forno de micro-ondas por 2 min até derreter completamente. Adicione 5 μL de YeaRed Nucleic Acid Gel Stain, misture bem e despeje no molde de gel; Depois que o gel solidificar, comece a adicionar as amostras.
   NOTA: Para preparar 1xTAE, use os reagentes listados na Tabela 1.
6. Adicione 1x TAE ao tanque de eletroforese e coloque no bloco de gel de agarose configurado, que deve ser imerso em TAE. Adicione 5 μL de tampão de carga 1x ao produto de digestão da etapa 1.4 e misture. Adicione a amostra ao gel. Além disso, adicione 6 μL de marcador ao gel também.
7. Execute o programa de eletroforese a uma tensão constante de 110 V por 35 min. Após a eletroforese, determine a posição da banda na amostra de acordo com o marcador e corte a tira de gel com uma lâmina limpa para recuperação do gel.
8. Execute a operação de recuperação de gel de acordo com as instruções do kit de purificação de gel maxi. Defina um banho-maria para 50 °C. Adicione o volume correspondente de solução NP ao tubo que contém o gel cortado conforme o kit. Pique o gel com uma ponta de pipeta para facilitar a dissolução e coloque-o em banho-maria. Agite o tubo de vez em quando e observe o processo de dissolução até que o bloco de gel esteja completamente dissolvido.
9. Pegue uma coluna de rotação, CA3, do kit. Adicione 500 μL de solução BL do kit na coluna de centrifugação e centrifugue a 2.000 x g por 1 min para equilibrar a coluna. Após a centrifugação, remova o líquido residual do fundo do tubo de coleta e coloque a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta.
10. Continue a centrifugação a 2.000 x g por 1 min. Descarte o líquido residual no fundo do tubo da centrífuga, adicione 600 μL de solução de NP e centrifugue 2.000 x g por 30 s; Descarte o líquido residual novamente. Repita a operação e descarte novamente o líquido residual.
11. Após a centrifugação, substitua o tubo de coleta de 2 mL por um novo tubo de 1,5 mL. Abra a tampa e deixe secar em local ventilado por 30 min para retirar completamente o etanol. Em seguida, adicione 40 μL pré-aquecidos de ddH₂O, centrifugue e elua o DNA necessário.
    NOTA: O PN deve ser adicionado com etanol anidro de acordo com as instruções. O uso de água pré-aquecida pode aumentar o rendimento.
12. Adicione 7 μL de produto de recozimento da etapa 1.3, 3 μL de produto de recuperação de gel da etapa 1.11, 1 μL de T4 DNA Ligase, 2 μL de 10x T4 Ligase Buffer e 7 μL de ddH₂O em um tubo de microcentrífuga e mantenha durante a noite a 16 ° C para obter o produto de ligação.
13. Adicione 10 μL de produto de ligadura e 70 μL de DH5α em um tubo de microcentrífuga em gelo por 30 min. Ajuste o banho-maria para 42 °C. Após o banho de gelo, coloque o tubo no banho-maria por 90 s e depois novamente no gelo por 2 min.
14. Adicione 600 μL de meio líquido Luria-Bertani (LB) ao tubo e agite em um shaker por 30 min. Ao mesmo tempo, irradiar uma placa de meio sólido LB dentro de um gabinete de fluxo laminar por 30 min. Após a incubação, distribua uniformemente 100 μL da solução na placa. Após o revestimento, coloque a placa de cabeça para baixo em uma incubadora bacteriana a 37 °C para cultura.
    NOTA: DH5α é geralmente armazenado a -80 °C. LB meio sólido é preparado usando os reagentes listados na Tabela 2. O meio líquido LB é preparado usando os reagentes listados na Tabela 3.
15. Selecione uma única colônia e expanda a colônia bacteriana por 14 h em um prato fresco. Pegue um tubo de centrífuga de 50 mL, adicione 50 mL de meio líquido LB, adicione 50 μL de ampicilina na proporção de 1:1000 e misture bem. Divida isso em novos tubos a 15 mL por tubo.
16. Verifique a placa de cultura para colônias brancas redondas com bom crescimento. Selecione-os com uma pipeta de 10 μL e transfira-os para o meio LB. Cultive em um shaker por 12 h e depois envie esta amostra para sequenciamento.
17. Compare os resultados do sequenciamento com o gRNA alvo para identificar a cepa com a sequência correspondente, Camk II δ-sgRNA, como a cepa alvo e, em seguida, extraia o plasmídeo.
18. Realize a extração de plasmídeo de acordo com as instruções do mini kit de plasmídeo. Adicione 500 μL de BL à coluna de adsorção CP3, centrifugue por 1 min a 2.000 x g e descarte o líquido residual. Volte a colocar a coluna de adsorção no tubo de recolha. Adicione 500 μL de solução bacteriana e centrifugue a 4.000 x g por 10 min.
19. Colete o fluxo. Centrifugue novamente e, após remover o sobrenadante, adicione 250 μL de P1 ao tubo da centrífuga com precipitação bacteriana e, em seguida, transfira-o para um tubo de microcentrífuga e vórtice. Adicione 250 μL de P2 e inverta suavemente para 6x-8x. Adicione 350 μL de P3 e inverta novamente suavemente por 6x-8x. Aparece um precipitado floculante branco.
20. Centrifugue por 10 min a 2.000 x g. Transferir o sobrenadante para uma nova coluna de adsorção CP3, centrifugar a 2.000 x g durante 30 s e remover o líquido residual. Adicione 600 μL de PW, centrifugue novamente a 2.000 x g por 30 s e remova o líquido residual. Adicione 600 μL de PW novamente, centrifugue a 2.000 x g por 30 s e remova o líquido residual.
21. Coloque a coluna de adsorção no tubo de coleta e centrifugue por 2 min a 2.000 x g para remover o PW residual. Em seguida, coloque a coluna de adsorção em um tubo de microcentrífuga limpo, deixe-a secar por 30 min e adicione 35 μL de ddH₂O pré-aquecido ao meio do filme de adsorção e, em seguida, armazene o produto resultante a -20 °C para testes subsequentes.
    NOTA: PW deve ser adicionado com etanol anidro de acordo com as instruções. O uso de água pré-aquecida pode aumentar o rendimento.

2. Extração de células da medula

1. Selecione camundongos KM com idade entre 8 e 9 semanas, machos e pesando cerca de 30 g. Fixe os camundongos na mão esquerda com a cabeça voltada para baixo e injete 150 μL de Pentobarbital sódico a 1% do lado do abdômen com uma seringa usando a mão direita. Confirme a anestesia beliscando o dedo do pé.
2. Realize a luxação cervical de camundongos, remova a tíbia com tesouras cirúrgicas e pinças e retire o excesso de tecido muscular circundante. Mergulhe a tíbia removida em PBS e lave, deixando apenas os ossos limpos.
3. Tome 1 mL de PBS em uma seringa para lavar as células da medula óssea de uma extremidade da tíbia até que o osso fique branco.
4. Recolha a suspensão celular e centrifugue a 800 x g a 4 °C durante 5 min. Depois de remover o sobrenadante, lise os glóbulos vermelhos com 500 μL de lisado de glóbulos vermelhos. Após 1 min, adicione 1 mL de tampão de separação para terminar o lisado de glóbulos vermelhos. Depois de centrifugar a 800 x g a 4 °C durante 5 min, retirar o sobrenadante e colocar as células no gelo para utilização posterior.
   NOTA: Se os glóbulos vermelhos estiverem completamente lisados, as células precipitam e nenhum glóbulo vermelho é visível. Se os glóbulos vermelhos ainda puderem ser vistos, eles podem ser lisados novamente, mas o tempo de incubação não deve ser muito longo para evitar danos a outras células.

3. Transfecção de quitosana

1. Preparação de quitosana: Pese 4 mg de quitosana e dissolva em 20 mL de solução de ácido acético 0,2 mg / mL. Ajuste o pH para 5,5 com NaOH 10 M. Pegue 500 μL desta solução e adicione-os a tubos de microcentrífuga individuais.
2. Adicione 2 μg, 3 μg, 4 μg e 5 μg de plasmídeos ABE a tubos individuais e dissolva-os em 500 μL de 30 mM Na₂SO_4. Misture 500 μL de solução de quitosana e 500 μL do plasmídeo.
3. Incube-os em banho-maria a 50-55 °C por 15 min. Depois de misturar bem as duas soluções, vortex por 15-30 s e deixe descansar por 30 min.
4. Caracterização da quitosana: Analise os diâmetros e potenciais zeta da quitosana usando espalhamento dinâmico de luz (DLS), com a concentração de quitosana mantida em 0,1 mg / mL em ddH₂O. Execute cada amostra 3x.
5. Lançar amostras de 0,1 mg/mL em um chip de silício. Adicione 20 μL das amostras ressuspensas a grades de 200 mesh e incube em temperatura ambiente por 10 min. Manchar as grades com ácido fosfotúngstico a 2% por 3 min e remover o líquido restante com papel de filtro. Observe com um microscópio eletrônico de transmissão.
6. Eficiência de encapsulamento de nanopartículas: Filtre o sobrenadante com um filtro de 0,1 μm para remover as partículas não precipitadas. Carregue o plasmídeo e meça a concentração com um espectrofotómetro a 260 nm. As eficiências calculadas do plasmídeo ABE e do plasmídeo de gRNA foram de 84% ± 0,37% e 85% ± 0,53%, respectivamente.
7. Injete 100 μL de quitosana embebida com plasmídeo em camundongos através da cavidade da medula óssea (etapa 5). Após 7 dias da injeção, isole as células da medula óssea e lise os glóbulos vermelhos conforme descrito no passo 2.
8. Adicione 2 mL de meio DMEM contendo soro a placas de cultura de células de 6 poços e adicione as células da medula óssea (aproximadamente 1 x 10⁶) suspensas em 500 μL de meio DMEM contendo soro. Meça a intensidade de fluorescência em um microscópio de fluorescência. O plasmídeo CaMK II δ-sgRNA tem fluorescência vermelha TagRFP quando excitado a 580 nm (Figura 2B).
   NOTA: O meio DMEM contendo soro é preparado usando os reagentes listados na Tabela 4.

4. Citometria de fluxo

1. Preparar diferentes dosagens de plasmídeos ABE: 2 μg, 3 μg, 4 μg e 5 μg, e entregar aos ratinhos recetores conforme descrito no passo 3. Após 7 dias, isole as células da medula óssea dos camundongos conforme descrito na etapa 3.
2. Recolha as células da medula óssea e centrifugue a 800 x g a 4 °C durante 5 min. Descarte o sobrenadante e lise os glóbulos vermelhos com 500 μL de lisado de glóbulos vermelhos. Após 1 min, termine a reação com 1 mL de tampão de separação e conte o número de células com um contador de células.
3. Transferir 1 x 10⁶ células para um novo tubo de microcentrífuga e centrifugar com 800 x g a 4 °C durante 5 min. Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda as células com 500 μL de PBS e transfira-as para um tubo de fluxo. Meça a eficiência por citometria de fluxo. Preparar um grupo de controlo de citometria de fluxo conforme descrito no passo 2.
   NOTA: Detritos celulares e células mortas com os sinais FSC mais baixos e localizados no canto inferior esquerdo do gráfico de dispersão FSC versus SSC (menos de 400) foram excluídos (Figura 3). Como os plasmídeos têm fluorescência vermelha TagRFP, eles podem ser classificados.

5. Injeção da cavidade da medula óssea

1. Selecione camundongos machos KM com idade entre 8 e 9 semanas de idade, pesando cerca de 30 g. Anestesize-os com uma injeção intraperitoneal de 150 μL de Pentobarbital sódico a 1% (etapa 2.1). Confirme a profundidade da anestesia beliscando o dedo do pé.
2. Fixe o mouse anestesiado em decúbito dorsal na mesa de operação e fixe o membro frontal do mouse com fita adesiva.
3. Desinfete a tíbia posterior de camundongos com um cotonete embebido em álcool. Encha o plasmídeo a ser injetado em uma seringa de 1mL com uma agulha de 26G. Remova as bolhas de ar e prepare-se para a injeção.
4. Toque na canela do mouse e segure a canela do mouse com os dedos. Determine a posição da agulha de injeção de modo que a diáfise tibial seja penetrada a partir do platô tibial na articulação do joelho do camundongo. Gire a agulha de injeção paralelamente à tíbia, esfaqueie a cavidade da medula óssea e injete lentamente (cerca de 3 s) para minimizar os danos aos camundongos.
5. Após a injeção, puxe lentamente a agulha (cerca de 3 s) e use imediatamente um cotonete embebido em álcool para parar o sangramento e desinfetar o local da punção.
6. Coloque suavemente os ratos em um ambiente quente (20-26 ° C), espere que os ratos se recuperem da anestesia e observe sua recuperação.

6. Sequenciamento de Sanger

1. Após 7 dias da injeção, colete células da medula óssea de camundongo conforme descrito na etapa 2 e isole o DNA genômico usando um kit de extração. Colete as células centrifugando a 2.000 x g por 1 min. Descarte o sobrenadante, adicione 200 μL de solução de GA e vibre com um misturador de vórtice. Adicione 20 μL de proteinase K e 200 μL de GB, misture e coloque em banho-maria a 70 °C por 10 min.
2. Após a incubação, adicione 200 μL de etanol anidro, agite por 15 s e, em seguida, coloque o líquido misturado na coluna de adsorção de suporte. Centrifugue a 2.500 x g por 1 min, descarte o líquido residual no fundo do tubo e adicione 500 μL de solução GD. Centrifugue e descarte o líquido residual, lave o pellet 2x com PW e, finalmente, seque-o, eluíndo-o com 40 μL de água pura.
   NOTA: PW deve ser adicionado com etanol anidro de acordo com as instruções.
3. Amplificar o gene alvo CaMKIIδ por PCR com a sequência de primer direto gctaaggtgataaatgtggcact e a sequência de primer reverso de ctagtgtgcgggccagattc. Prepare a reação de PCR adicionando 25 μL de tampão 2x, 1 μL de dNTP Mix, 2 μL de primer direto, 2 μL de primer reverso, 1 μL de DNA polimerase, 2 μL de DNA molde e 17 μL de ddH₂O. Execute o seguinte programa de PCR: 95 ° C por 3 min, 95 ° C por 15 s, 53,7 °C por 30 s, 72 °C por 60 s, 12 °C para preservação do calor.
4. Após a reação em cadeia da polimerase (PCR), prepare um gel de agarose a 1% e realize a eletroforese em gel de agarose a 110 V por 35 min (etapa 1.5, etapa 1.6). Corte a área do gel alvo após a eletroforese e envie para o sequenciamento de Sanger (Figura 4).

Plasmídeos in vitro foram injetados em camundongos por injeção intraóssea (Figura 1A). O tamanho médio das partículas das nanopartículas foi de cerca de 202,9 nm, o potencial foi de 2,77 mV e o PDI foi de 0,22 (Figura 1B). A Figura 1C mostra a forma da superfície das nanopartículas observadas como esféricas por microscopia eletrônica.

Para a pesquisa biomédica, o desafio de fornecer plasmídeos exógenos aos animais envolve melhorar a eficiência da entrega e da expressão gênica, ao mesmo tempo em que minimiza os danos aos animais para alcançar o efeito terapêutico desejado^15,16. Apresentamos um novo método de injeção intraóssea de entrega de plasmídeo ABE mediado por quitosana nas células da medula óssea de camundongos receptores. Essa estratégia...

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Anhui (2208085MC74, 2208085MC51) e pela Fundação de Pesquisa Científica do Departamento de Educação da Província de Anhui, China (KJ2021A0055).