Stała wiązania równowagi (K_b) określa ilościowo siłę oddziaływania białko-ligand. K_b można obliczyć w następujący sposób, gdy reakcja jest w równowadze:

gdzie P i L są odpowiednio niezwiązanym białkiem i ligandem, a PL jest kompleksem białko-ligand.

Ponieważ ilość związanego liganda jest również związana z szybkością wiązania liganda, eksperymenty mogą również określić K_b, badając szybkość asocjacji białko-ligand (k_on) i dysocjacji (k_off) przy użyciu następującego stosunku:

W związku z tym do określenia stałej wiązania równowagi stosuje się dwie kategorie testów wiązania – te, które mierzą stężenia równowagowe i te, które mierzą kinetykę reakcji. W takim przypadku reakcja musi być w równowadze w czasie pomiaru.

Sposób wyznaczania stężeń równowagowych zależy od pożądanej czułości i łatwości wykrywania sygnału. Z tych powodów najczęściej stosowane są testy spektroskopowe. W tych eksperymentach reakcja powoduje zmianę absorbancji reagenta lub produktu o danej długości fali, wykrywalną przez spektrofotometr UV-Vis. Alternatywnie, reagent lub produkt może być oznaczony sondą fluorescencyjną lub może zawierać wewnętrzny fluorofor. Następnie postęp reakcji można zmierzyć na podstawie zmiany fluorescencji. Testy te są wykonywane poprzez zmianę stężeń jednego reagenta, podczas gdy reszta eksperymentu jest utrzymywana na stałym poziomie. Wyniki można następnie przedstawić na wykresie i przeanalizować za pomocą różnych metod dopasowywania krzywych.

Interakcje między białkami i ligandami są również badane przy użyciu różnych technik biochemicznych i spektroskopowych. Analiza strukturalna, wykorzystująca krystalografię rentgenowską i spektroskopię NMR, pomaga w przewidywaniu interakcji białko-ligand poprzez symulacje molekularne. Podejścia teoretyczne i obliczeniowe, takie jak badania dokowania białek-ligandów, są szeroko stosowane do charakteryzowania pozycji i interakcji ligandów małocząsteczkowych, w tym kandydatów na leki. Komputerowe wspomaganie projektowania leków jest szybką i tanią alternatywą przyspieszającą tempo konwencjonalnych testów leków metodą prób i błędów.