이 연구는 LDLR 녹아웃 마우스의 대동맥궁과 뿌리에서 죽상경화성 병변 발생을 조사하여 죽상동맥경화증의 중증도 플라크 구성을 평가하기 위한 분리, 염색 및 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 연구에 사용된 조직학적 검사 외에도 죽상동맥경화증을 평가하기 위한 실용적인 기술에는 생화학적 마커, 분자 생물학 검사 및 혈관 초음파가 포함됩니다. 박리 절차의 정밀도는 죽상동맥경화증의 마우스 모델 내에서 생체 내 대동맥 박리를 수행하는 데 가장 큰 기술적 장애물이 됩니다.
시작하려면 안락사된 쥐를 1-2겹의 흡수성 종이로 덮인 폼 보드에 누운 자세로 놓습니다. 팔다리를 핀으로 고정하여 몸을 안정시킵니다. 생쥐의 복부에 75 % 에탄올을 뿌려 털을 청소하고 촉촉하게합니다.
집게를 사용하여 마우스의 복부 피부를 잡습니다. 그런 다음 가위를 사용하여 복부 바닥에서 목 꼭대기까지 피부를 자릅니다. 복벽을 열고 집게를 사용하여 흉골을 들어 올립니다.
횡격막과 갈비뼈를 모두 절단하여 흉강을 노출시킵니다. 경동맥을 쉽게 청소할 수 있도록 식도와 기관을 제거합니다. 간, 폐, 비장, 위장관, 췌장을 포함한 장기를 조심스럽게 제거하면서 신장과 복부 대동맥을 보존합니다.
장간막 동맥을 절개할 때는 장을 들어 올려 대동맥에서 멀리 절개하여 손상을 방지하십시오. 이제 마우스를 실체 현미경 아래에 위치시켜 명확한 관찰 영역을 제공하고 차가운 광원을 해부 영역에 정렬합니다. PBS를 채운 10ml 주사기를 사용하여 바늘로 좌심실 정점에 천천히 주입하고 대동맥의 확장을 관찰합니다.
해부 부위의 혈액과 체액을 티슈 페이퍼로 부드럽게 닦아내어 시야를 완전히 노출시킵니다. 그런 다음 집게로 흉부 대동맥의 횡격막 부분을 잡고 스프링 가위를 사용하여 대동맥과 흉부 근육 벽 사이의 결합 조직을 절단합니다. 집게로 심장을 부드럽게 당기고 흉부 대동맥을 들어 올립니다.
대동맥궁의 가지를 관찰하고 대동맥궁 주변의 외래 지방과 결합 조직과 흉부 대동맥을 따라 위쪽으로 가지를 해부합니다. 복부 대동맥과 총장골동맥을 흉부 대동맥을 따라 아래쪽으로 절개합니다. 심장 조직을 잘라내고 심방과 평행한 평면을 따라 심장의 아래쪽 절반을 자르고, 잘라낸 심장을 적절한 저장 매체에 넣습니다.
대동맥궁을 절개하기 전에 그 아래에 작은 어두운 색의 개스킷을 놓아 대비를 만듭니다. 대동맥궁 부위의 사진을 촬영합니다. 총장골동맥을 분기점 아래로 1-2mm 자르고, 척추를 따라 대동맥의 작은 가지를 잘라 빼냅니다.
신장 근처의 신장 동맥을 분리한 후 말단부에서 목에 있는 3개의 분지 혈관을 잘라냅니다. 마지막으로 심장 근처의 상행 대동맥을 절단합니다. 4ml 원심분리기 튜브에 1.5%파라포름알데히드 용액 1ml를 미리 준비합니다.
준비된 튜브에 대동맥을 넣고 최소 24시간 동안 실온에 고정합니다. 다음으로, 대동맥이 건조되는 것을 방지하기 위해 PBS가 포함된 페트리 접시로 대동맥을 옮깁니다. 실체 현미경 아래에서 집게와 스프링 가위를 사용하여 남아 있는 외래 지방을 조심스럽게 제거하여 플라그 정량화의 간섭을 줄입니다.
스프링 가위를 사용하여 내부 세로 축을 따라 대동맥을 조심스럽게 잘라냅니다. 순차적으로, 측면을 따라 대동맥궁의 세 가지를 대동맥궁의 곡률 수준까지 잘라 완전히 퍼지도록 합니다. 이 단계에서는 Oil Red O 염색을 진행하거나 향후 분석을 위해 대동맥을 4% 파라포름알데히드에 보관하십시오.
절단된 열린 대동맥을 6개의 웰 플레이트에 놓습니다. 각 웰에 멸균 이중 증류수 1ml를 넣고 셰이커에서 5분 동안 세척합니다. 6개의 웰 플레이트를 흄 후드에 놓고 눈에 띄는 워터마크가 남지 않을 때까지 20분 동안 자연 건조합니다.
각 웰에 갓 준비한 Oil Red O 작업 용액 1ml를 추가합니다. 플레이트를 20분 동안 흔든 후 웰에서 Oil Red O 용액을 제거합니다. 각 웰에 2ml의 멸균 이중 증류수를 넣고 5분 동안 씻습니다.
세 번 씻은 후 대동맥을 이중 증류수에 보관하십시오. 대동맥을 슬라이드로 옮기고 슬라이드 아래에 검은색 고무 패드를 놓아 대비를 높입니다. 대동맥을 벌리십시오 view실체 현미경 아래로.
이제 슬라이드를 흰 종이에 올려 대비를 더욱 강화합니다. 슬라이드 옆에 눈금자를 놓고 카메라를 사용하여 사진을 가져옵니다. 처리된 대동맥을 PBS 1ml가 들어 있는 1.5ml 원심분리기 튜브에 보관하여 촉촉하게 유지하십시오.
서양식 다이어트를 먹인 LDLR 녹아웃 마우스의 체중은 차우 다이어트를 먹인 쥐에 비해 크게 증가했습니다. 혈장 트리글리세리드와 총 콜레스테롤 수치는 대조군보다 서구식 식단 그룹에서 유의하게 높았습니다. 대동맥 오일 레드 O 염색은 차우 다이어트를 하는 마우스에 비해 서양식 다이어트를 먹인 LDLR 녹아웃 마우스의 동맥에 심각한 지질 축적을 보여주었습니다.
지질 침전물 증가는 더 심각한 죽상경화성 병변과 상관관계가 있었다. 대동맥근 병변 영역과 괴사 코어는 차우 다이어트를 먹인 마우스에 비해 서양식 식단을 먹인 마우스에서 유의하게 더 컸습니다. 대동맥 뿌리 병변 부위와 괴사 부위를 정량화한 결과, 서양식 식단이 LDLR 녹아웃 마우스에서 죽상경화성 플라크 형성을 악화시키는 것으로 확인되었습니다.
