제 박사 학위 연구는 박테리아가 분비하는 단백질을 연구하는 데 중점을 두고 있습니다. 저는 특히 이러한 분비 단백질 중 일부가 인체 감염을 일으키는 데 중요한지 이해하고 싶습니다. 최근에 분리된 임상 박테리아를 다루는 데 있어 가장 큰 어려움은 항생제 내성인데, 이는 유전자 결실 및 유전자 보완과 같은 항생제 선택에 의존하는 분자 유전 기술을 방해합니다.
이 클로닝 프로토콜은 IVA가 E.coli 형질전환 전에 플라스미드 조립을 위한 특수 효소 및 순차적 효소 반응의 필요성을 없애기 때문에 더 빠르고 비용 효율적입니다. 먼저 컴퓨터 시스템에서 특수 DNA 분석 소프트웨어를 실행합니다. 원하는 플라스미드를 인위적으로 조립합니다.
그런 다음 각 DNA 단편에 결합하는 프라이머를 설계합니다. PCR 튜브에 상동 DNA가 포함된 프라이머와 상용 키트를 사용하여 분리된 DNA를 결합합니다. 그런 다음 PCR 실행으로 DNA를 증폭합니다.
PCR 반응이 완료되면 2마이크로리터 분취액을 피펫으로 추출합니다. 로딩 염료와 결합하십시오. DNA 단편을 분리하기 위해 1% 아가로스 겔에 아가로스 젤 전기영동을 수행합니다.
그런 다음 자외선 또는 LED 트랜스 조명기를 사용하여 조각을 시각화합니다. 다음으로, 1마이크로리터의 DpnI를 PCR 반응 튜브에 직접 첨가하여 메틸화된 템플릿 DNA를 제거합니다. 섭씨 37도에서 15분 동안 또는 밤새 반응을 배양합니다.
핵산 정제 키트를 사용하여 잔류 효소, 염, 프라이머 이량체 및 저분자량 DNA 산물을 제거합니다. 분광 광도계를 사용하여 정제된 단편의 DNA 농도를 정량화합니다. 순수 증폭 플라스미드 DNA를 얻습니다.
각 in vivo assembly 반응에 필요한 플라스미드의 양을 계산하고 DNA를 삽입합니다. 이제 계산된 부피의 플라스미드를 결합하고 DNA를 사전 냉각된 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 삽입합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
다음으로, 25-100 마이크로리터의 recA-chemically competent Escherichia coli를 튜브에 해동하여 피펫팅합니다. DNA 혼합물을 부분 표본으로 옮깁니다. 열충격 변형을 수행하려면 먼저 E.coli와 DNA의 혼합물을 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
튜브를 섭씨 42도의 수조에 1분 동안 옮깁니다. 그런 다음 다시 얼음 위에 올려 2분 동안 옮깁니다. LB 매체를 무균 방식으로 튜브로 옮겨 부피를 1ml로 구성합니다.
1mL 혼합물을 유리 배양 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 플라스미드로 인코딩된 항생제 선별 마커의 회수 및 생산을 위해 진탕 인큐베이터에 넣습니다. 회복 후에, 대략 100개에서 1, 단단한 선택 매체에 전이 반응의 000 마이크로리터를 예금하십시오.
멸균 세포 스프레더를 사용하여 오거 배양 플레이트에 부분 표본을 분산시킵니다. 나머지 형질전환된 세포를 13, 000G에서 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 버리고 세포 펠릿을 100마이크로리터의 멸균 배지에 다시 현탁시킵니다.
앞에서 설명한 것처럼 다시 부유한 세포를 고체 선택 매체에 증착합니다. 그런 다음 배양 플레이트를 뒤집습니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣으십시오.
변형된 E.coli 배양액이 포함된 배양 플레이트를 인큐베이터에서 제거합니다. 열거하기 위해 식민지를 직접 세십시오. 적절한 항생제가 보충된 멸균 성장 배지를 멸균 배양 튜브로 옮깁니다.
멸균 전달 루프를 사용하여 콜로니를 선택하고 세포를 배양 배지에 접종합니다. 흔들리는 인큐베이터에서 배양 튜브를 배양합니다. 다음 날, 시판되는 플라스미드 분리 키트를 사용하여 박테리아 배양에서 플라스미드 DNA를 분리합니다.
플라스미드가 올바르게 조립되었는지 확인하려면 분광 광도계를 사용하여 DNA의 농도를 정량화하십시오. 진단용 제한 분해 반응을 위해 50 - 150 나노그램의 플라스미드 DNA 분취량을 피펫으로 추출합니다. 플라스미드 DNA의 예상 절단 부위를 기반으로 선택된 제한 효소를 추가합니다.
제한 반응이 완료되면 튜브에 로딩 염료를 추가합니다. 전체 혼합물을 1%아가로스 젤에 넣고 전기영동 실행을 수행합니다. 실행 후 UV 또는 LED 트랜스 일루미네이터로 DNA 단편을 시각화하여 후자와 비교합니다.
2개의 분리된 플라스미드 클론의 효소 분해는 플라스미드 클론 1에 대해 2.3 킬로염기쌍의 단일 DNA 생성물을 생성했으며, 이는 이것이 PSU 19 단독임을 나타냅니다. 플라스미드 클론 2의 단일 절단은 단일 3 킬로 염기쌍 DNA 산물과 이중 절단 후 2.3 킬로 염기쌍 및 770 킬로 염기쌍의 두 DNA 산물을 생성했습니다.
