본 연구는 NMR 기반 대사체학을 사용하여 중증 중환자실 환자에서 조절되지 않는 대사 산물 및 생화학적 경로를 식별하며, 중증 폐 질환인 ARDS의 환자도 포함했습니다. 대사 신호를 프로파일링하고 비교함으로써 질병 진행과 관련된 생화학적 장애를 밝히고 결과를 개선하기 위해 치료를 맞춤화하는 것을 목표로 합니다. 실제로, 우리는 경증, 중등도, 중증 ARDS 환자를 포함한 모든 범주의 ARDS 환자에서 대사 조절 장애에 대한 이해의 격차를 해소하기 위해 노력하고 있습니다.
우리의 통찰력을 향상시키고, 질병과 진행에 대한 더 나은 이해를 위해, 정확하고 개인화된 의학을 제공하여 환자의 결과를 개선하는 전반적인 목표를 가지고 있습니다. NMR은 간편한 시료 전처리를 제공하여 재분석을 위한 혈청 무결성을 보존하고 화학적 유도체화 없이 알려지거나 알려지지 않은 대사 산물을 검출합니다. 재현 가능한 정량적 데이터를 제공하여 신뢰할 수 있는 대사 산물 측정을 보장합니다.
표적 접근 방식과 달리 NMR은 대사 변화에 대한 민감하고 편향되지 않은 탐색을 가능하게 하므로 질병 진행의 시그니처와 경로를 발견하는 데 이상적입니다. 이번 발견은 아직 연구되지 않은 여러 단계의 대사 변화를 밝혀냄으로써 ARDS 연구를 강화할 것입니다. NMR 기반 대사체학을 사용하여 조절되지 않는 대사 산물 및 경로를 식별하여 조기 진단, 예후, 보다 시기 적절한 예측 및 치료를 위한 잠재적인 시그니처를 유도하는 것을 목표로 합니다.
이 접근 방식은 개인화된 관리를 발전시키고 다중 상태 대사 프로파일링에 대한 지식을 심화합니다. 우리의 결과는 다음과 같은 새로운 과학적 질문의 길을 열었습니다.ARDS의 여러 단계에서 확인된 특정 대사 산물은 질병 진행에 어떤 영향을 미치는가? 이러한 조절 장애 경로가 조기 치료 개입의 표적이 될 수 있습니까?
또한 이러한 대사 변화는 다른 호흡기 또는 염증성 질환에 따라 어떻게 다를까요? 먼저 멸균 바늘을 사용하여 경증 또는 중등도의 급성 호흡곤란 증후군 또는 ARDS로 진단된 환자의 동맥에서 2ml의 혈액을 채취합니다. 혈액을 멸균 바이알에 옮기고 실온에서 30분 동안 응고시킵니다.
응고된 혈액을 3, 100G에서 15분 동안 원심분리하여 혈청을 분리합니다. 혈청을 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 400-500마이크로리터의 분취량을 만듭니다. 튜브에 환자의 세부 정보를 표시하고 섭씨 80도에서 보관하십시오.
NMR 실험의 경우, pH 변화를 최소화하기 위해 250마이크로리터의 혈청 분취액과 250마이크로리터의 식염수 인산액을 혼합합니다. 균일한 혼합을 보장하기 위해 약 15초 동안 혼합물을 소용돌이치십시오. 준비된 샘플을 0.05밀리몰 농도의 TSP가 포함된 동축 인서트가 있는 깨끗한 NMR 튜브로 옮깁니다.
다음으로 NMR 튜브를 자석에 넣습니다. WRPA를 입력하고 적절한 실험 번호를 선택하여 CPMG 펄스 프로그램으로 양성자 실험을 설정합니다. 제목 옵션을 클릭하여 환자의 이름 및 기타 필요한 세부 정보를 입력합니다.
lock을 입력하고 Enter 키를 눌러 자기장을 잠급니다. 그런 다음 90% 물 및 10% 중수소 산화물 옵션을 선택합니다. 그런 다음 ATMM을 입력하고 Enter 키를 눌러 프로브의 튜닝 및 일치를 수행합니다.
다음으로, Acquisition Parameters 옵션에서 128개 스캔에 걸쳐 64, 000 포인트로 매개변수를 선택하여 최적화 데이터를 수집합니다. 릴렉스 지연 5초, 스펙트럼 스윕 폭 12PPM, 에코 시간 200마이크로초를 300회 반복으로 설정합니다. 지수 윈도우 함수를 사용하여 0.3 헤르츠의 선 확장을 적용합니다.
다음으로, NMR 처리 및 분석 도구를 사용하여 NMR 스펙트럼을 획득합니다. 최종 스펙트럼을 얻으면 APK 및 ABSN을 입력하여 각각 위상 보정과 기준선 보정을 수행합니다. 그런 다음 상단 패널에서 Calibrate Axis 옵션을 클릭하고 자동 또는 수동으로 TSP 피크를 0PPM으로 교정합니다.
마지막으로, 추가 분석을 위해 NMR 시스템에서 획득한 데이터를 워크스테이션으로 전송합니다. 경증 또는 중등도 ARDS로 진단된 환자의 NMR 스펙트럼을 획득한 후 데이터 처리를 위한 NMR 대사 산물 정량화 소프트웨어를 엽니다. Whitaker 방법을 사용하여 수동 기준선 보정을 수행하려면 NMR 대사 산물 정량화 소프트웨어의 프로세서 모듈에서 스펙트럼 파일을 엽니다.
baseline correction을 선택한 다음 Whitaker method를 선택합니다. 전체 스펙트럼에서 피크의 기저부에 점을 배치합니다. 완료되면 baseline-corrected 스펙트럼 파일을 단일 폴더에 저장합니다.
다음으로, 프로파일러 모듈을 사용하여 스펙트럼 비닝을 수행하려면 Tools, Batch Process, Spectral Binning을 차례로 선택합니다. 통계 분석을 위한 최종 비닝 시트를 생성하려면 모든 기준선 보정된 스펙트럼 파일이 있는 폴더를 선택합니다. 스펙트럼을 0.01에서 0.04ppm 사이의 정의된 스펙트럼 너비를 가진 동일한 크기의 Bin으로 나눕니다.
버킷 크기와 시작 및 끝 PPM 값을 지정합니다. 출력 범주화 시트를 저장할 폴더를 선택합니다. 스펙트럼 간섭을 방지하기 위해 물과 용매 TSP에 해당하는 화학적 이동 영역을 제외합니다.
최종 스프레드시트는 한 행에 샘플 이름을 표시하고 다른 행에는 해당 PPM과 함께 빈 값을 표시합니다. 통계 분석을 수행하기 전에 일부 정규화, 로그 변환 및 파레토 스케일링을 사용하여 데이터를 정규화합니다. 다변량 분석의 경우 주성분 분석, 부분 최소 제곱 판별 분석 및 직교 부분 최소 제곱 판별 분석을 수행하여 그룹 간의 차별을 관찰하고 대사 프로필의 차이를 담당하는 모든 대사 산물에 대한 투영 점수의 변수 중요도를 산출합니다.
스튜던트 t-검정을 수행하여 p-값이 0.05 미만인 유의한 대사 산물을 식별합니다. T-검정은 대사 산물 농도의 차이를 표시하는 상자 수염 플롯을 생성합니다. 그런 다음 바이오마커 분석을 수행하여 수신기 작동 특성 곡선 그래프 아래 영역을 생성합니다.
1보다 큰 투영 점수, 0.05보다 작은 Bonferroni 보정 p-값, 0.8보다 큰 곡선 아래 면적의 변수 중요도를 기반으로 유의한 대사 산물의 최종 목록을 선택합니다. Human Metabolome Database를 사용하여 특정 PPM 값에 해당하는 대사 산물을 식별합니다. 정량화를 시작하기 전에 프로세서 모듈을 사용하여 연구를 위해 선택된 참조 화합물을 보정합니다.
Calibrate Chemical Shift Indicator 옵션을 클릭하고 기준 화합물의 농도를 입력합니다. 소프트웨어 피크를 스펙트럼 참조 피크로 끌어다 놓고 높이와 너비를 조정합니다. 스펙트럼 참조 피크가 소프트웨어의 피크와 정렬되면 Accept를 클릭합니다.
다음으로, 프로파일러 모듈에서 원하는 스펙트럼을 열고 연구에 적합한 화합물 라이브러리를 선택합니다. 화면 하단에 대사 산물 목록이 표시됩니다. 목록에서 관심 있는 대사 산물을 선택합니다.
화면 상단 모서리에 있는 PPM 값을 클릭합니다. 스펙트럼을 대사 산물의 특정 PPM 규모로 확대합니다. 이 시점에서 두 개의 피크가 화면에 나타나는데, 하나는 기록된 데이터를 나타내고 다른 하나는 소프트웨어 피크를 나타내는 점선으로 표시됩니다.
소프트웨어 피크를 드래그하여 기록된 피크에 정렬하고 높이와 위치를 그에 맞게 조정합니다. 피크가 적절하게 정렬되면 Concentration in millimolar 제목 아래에 표시된 값에서 대사 산물의 농도를 읽습니다. 출력 파일을 생성하려면 Tools 메뉴에서 Batch Operations 옵션을 클릭하고 출력 파일을 저장할 폴더를 지정합니다.
주성분 분석(Principal Component Analysis)은 경증 ARDS 환자군과 중등도 ARDS 환자 군 간에 뚜렷한 군집을 보여주었습니다. Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis는 경증 ARDS 그룹과 중등도 ARDS 그룹 간의 명확한 차이를 보여주었으며 대사 차이를 강조했습니다. 학생의 t-테스트 및 바이오마커 분석은 경증과 중등도 ARDS의 주요 조절 장애 대사 산물을 밝혔습니다.
젖산염과 이소류신은 ARDS의 중증도와 상관관계가 뚜렷한 대사 산물 조절 장애로 확인되었습니다.
