부상 모델은 생체 내 재생을 연구하는 데 없어서는 안될 필수 요소이지만 장내 재생을 조사하는 것은 기술적인 과제임이 입증되었습니다. 종단 이미징 프로토콜의 부족으로 인해 장 재생을 조율하는 세포 및 조직 규모 역학에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 없었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 단일 음와 규모로 조직 손상을 국소적으로 유도하고 시간과 공간 제어 방식으로 단일 선와 또는 더 큰 장 필드의 광자 기반 레이저 절제 손상에 대한 살아있는 마우스의 장 상피의 재생 반응을 따르는 생체 내 현미경 방법을 설명합니다.
그 후, 장기적이고 반복적인 생체내 이미징을 통해 시간 경과에 따른 손상 부위를 추적할 수 있으며 여러 주에 걸쳐 조직 회복 중 선와역학을 모니터링할 수 있습니다. 수술 4-6주 전에 해바라기유에 용해된 타목시펜을 주사하여 생쥐를 유도한다. 진통제를 바르고 수술 30분 전에 부프레노르핀 200마이크로리터를 피하 주사합니다.
수술 전 24시간 식수에 카프로펜을 투여하십시오. 생물학적 위험 캐비닛에 고압 증기 멸균 수술 도구를 도입하십시오. 가열 패드를 켜고 온도를 섭씨 37도로 설정합니다.
이미징하기 최소 4시간 전에 현미경의 온도 조절 챔버를 켭니다. 기후 챔버 내부의 온도를 섭씨 37도로 안정적으로 유지하십시오. 두 개의 광자 현미경, 스캐너 및 레이저를 켭니다.
이미징 소프트웨어를 실행합니다. 레이저의 파장을 960나노미터로 조정하고 셔터를 엽니다. 2 내지 3%이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시키고, 멸균 천으로 덮인 가열 패드에 올려 놓는다.
초당 한 번의 호흡 빈도와 호흡의 질을 평가하고 마우스의 반사를 확인하여 마취 깊이를 확인하십시오. 눈 연고로 마우스의 눈을 가리십시오. 200 마이크로 리터의 미리 데워진 멸균 식염수를 피하 주사하십시오.
복부를 면도하고 머리카락을 제거하십시오. 수술 부위의 멸균 천을 교체하십시오. 직장 프로브를 삽입하여 마우스의 온도를 모니터링합니다.
온도는 약 섭씨 37도여야 합니다. 새 멸균 장갑을 착용하십시오. 소독액을 번갈아 가며 문지른 다음 80% 에탄올을 세 번 사용하여 수술 부위를 원형으로 청소합니다.
멸균 수술용 드레이프로 마우스를 덮습니다. 마우스의 반사를 확인하십시오. 멸균 메스를 사용하여 피부를 통해 10mm 수직 정중선 절개를하십시오.
가위를 사용하여 linea alba를 절개하여 복직근을 분리하고 복부를 엽니다. 미리 데워진 식염수에 흠뻑 적신 멸균 면봉을 사용하여 마우스의 맹장을 찾아 기준점으로 사용하십시오. 거즈 조각을 작게 자르고 예열 된 멸균 식염수에 적셔 절개 부위 위에 놓습니다.
미리 데워진 멸균 식염수에 흠뻑 적신 멸균 면봉으로 장을 꺼냅니다. 멸균 된 미리 데운 식염수를 첨가하여 장을 수분을 유지하십시오. 마우스를 예열된 멸균 이미징 상자로 옮깁니다.
멸균 유리 위에 장을 놓습니다. 이미징 상자의 흡입 튜브 안에 마우스 머리를 넣습니다. 필요한 경우 멸균 플렉시블 필름과 테이프로 마우스를 고정합니다.
마우스가 들어 있는 이미징 상자를 현미경 챔버에 넣습니다. 15분마다 직장 프로브를 통해 호흡의 빈도와 깊이, 체온을 확인하여 이미징 중에 마우스를 모니터링합니다. 이소플루란은 1에서 2% 사이로 유지되어야 합니다현미경의 IP를 사용하여 장에서 영역을 찾습니다.
현미경의 내부 카메라를 사용하여 관심 영역의 넓은 시야를 확보합니다. 다광자 현미경의 960 나노미터 레이저를 사용하여 관심 영역을 이미지화합니다. 실험에 사용된 형광형에 따라 레이저 출력과 파장을 조정합니다.
이 예에서, crypts 발현 막은 적색 형광 단백질이고, 저용량 타목시펜으로 유도할 때 녹색 형광 단백질로 확률적으로 표지된다. 관심 영역의 3미크론의 10 내지 20 단계 Z 스택을 획득한다. 이전에 타일 이미지에서 단일 위치 또는 여러 위치를 선택합니다.
32 및 124 x 124 픽셀 해상도로 이미징 소프트웨어의 위반점 보정 기능을 사용하여 스캔 속도 400Hz에서 3초에서 10초 동안 양방향 스캐닝 속성을 사용하여 목표로 하는 손상의 크기에 따라 사용합니다. 지하실 영역에서의 손상의 시작은 녹색 및 적색 채널 모두에서자가 형광의 증가에 의해 인식 될 수 있습니다. 절제 후 손상된 부위의 Z 스택을 획득하여 손상 위치와 정도를 확인합니다.
동일한 마우스의 여러 영역에 대해 앞의 두 단계를 반복합니다. 마취 상태에서 마우스를 멸균 봉합 부위에 놓고 멸균 드레이프로 덮습니다. 예열된 멸균 식염수에 흠뻑 적신 멸균 면봉을 사용하여 노출된 장을 복부에 다시 삽입합니다.
흡수성 봉합사를 사용하여 간단한 연속 봉합을 수행하여 linea alba를 봉합합니다. 수술 매듭으로 봉합사의 사지를 닫으십시오. 스킨 레이어와 동일한 단계를 반복하십시오.
이소플루란 스테이션을 끄고 이미징 상자와 인레이를 청소하고 살균합니다. 케이지가 1시간 동안 가열 패드에 놓이는 동안 마우스가 수술에서 회복되도록 합니다. 수술 후 6-12시간 동안 200마이크로리터의 부프레노르핀을 피하 주사합니다.
수술 후 72시간 동안 식수에 카프로펜을 투여합니다. 마우스의 무게를 측정하고 수술 후 일주일 동안 매일 복지를 모니터링합니다. 첫 번째 이미징 세션 후 최소 1주일 후 두 번째 시점에서 수술과 생체 내 이미징을 반복합니다.
혈관 패턴을 사용하여 첫 번째 시점에서 동일한 관심 영역 이미지를 다시 찾습니다. 마우스가 다른 시점에서 이미지화되지 않는 경우 마취 하에 자궁경부 탈구를 수행하여 마우스를 희생합니다. 그렇지 않으면 수술 부위 폐쇄 및 수술 후 관리를 계속하십시오.
K19-Cre ERT mTmG 마우스에 타목시펜을 주사하여 수술 및 첫 번째 이미징 세션 4-6주 전에 GFP로 세포의 확률적 표지를 유도했습니다. 마우스의 장을 외과적으로 노출시키고 관심 영역의 카메라와 형광 이미지를 획득한 후 다광자 레이저의 위반점 설정을 사용하여 선와를 제거합니다. 손상의 시작은 녹색 및 적색 채널 모두에서자가 형광의 증가로 인식 할 수 있습니다.
한 달 후 같은 절차가 반복되고, 맥관 구조는 같은 지역을 다시 찾는 랜드 마크로 사용됩니다. Lgr5-eGFP 색종이 모델을 사용하여 시간이 지남에 따라 다양한 색상으로 표시된 지하실을 추적하여 복구 역학을 매핑할 수 있습니다. 이 예에서 녹색의 크립트는 Lgr5 Cre를 나타내고 마젠타의 크립트는 색종이 색으로 표시됩니다.
레이저 절제 후 2주 후에 다양한 재생 모드가 관찰됩니다. 일부 지역은 변경되지 않은 상태로 유지되는 반면 다른 지역은 선실 분열의 형태로 리모델링을 나타내므로 하나의 지하실을 두 개로 나누거나 융합하여 두 개의 지하실을 하나로 병합하거나 지하실이 사라집니다. 생체 내 현미경 검사법과 결합된 레이저 절제는 정의된 관심 영역에 대한 손상을 제한합니다.
이를 통해 손상 위치와 손상 정도를 제어할 수 있습니다. 손상 심각도를 조절하여 지하실 또는 전체 장 필드를 제거하여 지하실 규모에서 재생 반응에 대해 알려줄 수 있습니다. 공간 제어 외에도 레이저 절제는 동일한 마우스의 항상성 및 재생 조건 모두에서 동일한 장기를 이미징하는 것 외에도 손상 시작 시간을 정확하게 측정할 수 있으므로 이전 손상 모델의 정밀도를 능가합니다.
레이저 절제 및 반복적인 생체 내 이미징의 적용은 재생, 면역학 및 암 연구를 아우르는 다양한 연구 질문과 다양한 과학 분야를 위한 플랫폼으로 활용될 수 있습니다.
