이 프로토콜은 단일 소 난소에서 초기 단계의 전방 난포를 효율적이고 반복 가능한 분리를 허용하고 비 소 종에서 난소 난포 형성을 연구하기위한 새로운 기회를 창출합니다. 단일 난소에서 더 많은 수의 난포를 사용함으로써이 기술은 난소 수확 전에 생체 내 치료를 가능하게하거나 난소 생검을 통해 동일한 동물로부터 시간이 지남에 따라 여러 샘플을 채취 할 수 있습니다. 초기 단계의 전방 난포의 분리 및 냉동 보존은 화학 요법과 같은 생식선 독성 치료를받는 젊은 여성의 생식력 보존과 멸종 위기에 처한 종의 생식 질 보존을위한 귀중한 옵션이 될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 Stephanie McDonnell, Amanda Morton 및 Juliana Candelaria, 내 실험실의 박사 과정 학생이 될 것입니다. 시작하려면 실험실의 난소를 Pen-Strep이 포함 된 따뜻하고 멸균 된 PBS로 옮기고 작은 antral 난포가 많고 눈에 띄는 황체가없는 난소를 선택하십시오. 가위를 사용하여 난소에서 과도한 결합 조직과 지방을 제거하십시오.
하나의 난소를 벤치 용지의 도마로 옮깁니다. 메스를 사용하여 한 인대 부착 부위에서 반대쪽 부착 부위까지 세로로 난소를 반으로 자릅니다. 처리 할 도마에 난소의 절반을 유지하고 난소의 나머지 절반을 Pen-Strep이 들어있는 따뜻한 PBS에 다시 넣습니다.
수질을 제거하려면 노출 된 수질이 위쪽을 향하도록 피질을 절단하지 않고 표면에서 약 2mm 떨어진 난소의 곡률을 따라 자릅니다. 수질의 대부분을 제거하기 위해 컷을 잘라냅니다. 상피가 위쪽을 향하도록 난소를 반으로 뒤집고 메스를 사용하여 피질에서 수질 절단을 완료하고 인대에 연결된 난소 조각 가장자리 주위에 남아있는 흰색 결합 조직을 잘라냅니다.
수질의 대부분이 제거되면 메스를 사용하여 피질을 약 1mm 두께로 자르고 메스를 앞뒤로 작은 동작으로 조작하여 나머지 수질을 면도 한 다음 각 난소 피질 절반을 두 조각으로 자릅니다. 자를 준비가 될 때까지 Pen-Strep이 들어있는 따뜻한 PBS에 피질 조각을 보관하십시오. 피질 한 조각을 티슈 초퍼의 페트리 접시로 옮기고 Pen-Strep이 들어있는 따뜻한 PBS 서너 방울로 티슈를 적십니다.
한 쌍의 집게로 티슈 조각을 안정적으로 잡고 재설정 버튼을 한 번 눌러 티슈 초퍼를 시작합니다. 피질의 전체 조각을 스트립으로 자른 후 블레이드 홀더 손잡이를 사용하여 페트리 접시에서 블레이드를 들어 올리고 집게를 사용하여 블레이드에서 조직을 제거합니다. 플레이트 홀더를 90도 회전시킨 후 다시 재설정 버튼을 누르고 블레이드를 티슈 스트립에 완전히 통과시킵니다.
블레이드 홀더 손잡이를 사용하여 페트리 접시에서 블레이드를 들어 올리고 집게를 사용하여 앞에서 설명한 대로 블레이드에서 티슈를 제거합니다. 전사 피펫과 Pen-Strep이 포함 된 따뜻한 PBS를 사용하여 잘게 잘린 티슈를 예열 된 50 밀리리터 원추형 튜브로 씻습니다. 원추형 튜브를 물이나 구슬 욕조로 되돌려 다진 조직을 따뜻하게 유지하면서 난소의 다른 세 반쪽과 함께 자르기 절차를 반복합니다.
최상의 절단 결과를 얻으려면 너트 드라이버를 사용하여 절단 암에서 너트를 제거하고 와셔와 블레이드 걸쇠를 제거하십시오. 집게를 사용하여 도마에서 날을 제거하십시오. 사용하지 않은 가장자리가 페트리 접시를 향하도록 뒤집고 다시 다마 위에 놓습니다.
균질화기 장치가 연결되어 있고 속도가 두 번째 막대로 설정되어 있는지 확인한 후 제조업체의 사양에 따라 10mm 발생기 프로브를 장치에 삽입합니다. 다음으로, 1 분 동안 타이머를 설정하고 프로브를 하나의 난소에서 잘게 잘린 피질 조직을 포함하는 50 밀리리터 원추형 튜브에 삽입하고 Pen-Strep이 포함 된 PBS가 들어있어 튜브를 25 밀리리터 라인까지 채 웁니다. 프로브가 삽입되는 깊이는 챔버 바닥에서 측정 한 액체 높이의 1/3이어야합니다.
타이머가 시작되면 균질화기를 켜서 프로브의 바닥이 튜브에 닿지 않도록 하고 균질화기가 켜져 있는 동안 튜브를 가만히 유지합니다. 균질화 1 분 후 튜브에서 프로브를 제거한 다음 집게를 사용하여 로터 나이프와 로터 튜브 사이의 공간에서 통풍구를 막는 결합 조직 또는 프로브에 붙어있는 피질 조각을 제거하고 튜브에 다시 넣습니다. 분산된 조직을 치즈천으로 덮인 깔때기에 붓고 삼각 플라스크에 삽입하고 따뜻한 PBS를 사용하여 튜브의 내용물을 깔때기로 헹굽니다.
마지막으로 따뜻한 PBS로 치즈 천을 헹굽니다. 작은 조각의 액체가 조직 조각 주위의 치즈 천을 아래로 비틀고 치즈 천에서 과도한 액체와 조직이 모두 제거 될 때까지 짜서 천의 구멍을 통과하도록합니다. 깔때기 위의 치즈 천을 다시 연 후 전사 피펫을 사용하여 Pen-Strep이 포함 된 PBS로 치즈 천을 헹구고 다시 천을 통해 잔류 조직 조각을 짜십시오.
지혈제를 사용하여 300 마이크로 미터 세포 여과기를 200 밀리리터 비커 위에 놓고 세포 여과기를 통해 Erlenmeyer 플라스크에 여과액을 붓습니다. 셀 스트레이너가 티슈로 막히면 비커에 부드럽게 두드린 다음 스트레이너를 거꾸로 뒤집고 큰 티슈 파편을 벤치 페이퍼에 두드립니다. 조직 조각이 남지 않을 때까지 Pen-Strep이 포함 된 따뜻한 PBS를 사용하여 플라스크의 내용물을 헹구고 세포 여과기에 붓습니다.
다음으로, 두 번째 200 밀리리터 비이커 위에 지혈제로 40 마이크로 미터 세포 스트레이너를 잡고, 첫 번째 200 밀리리터 비커에 존재하는 모든 초기 여과액을 스트레이너를 통해 부은 다음, 조직 조각이 남지 않을 때까지 Pen-Strep이 함유 된 따뜻한 PBS를 사용하여 비커의 내용물을 헹구고 세포 스트레이너에 부어 넣습니다. 18 게이지 바늘을 20 밀리리터 주사기에 장착 한 후 주사기에 여포 세척 매체를 채 웁니다. 지혈제를 사용하여 40마이크로미터 세포 여과기를 정사각형 페트리 접시 위에 거꾸로 잡고 주사기를 사용하여 세포 여과기의 내용물을 접시에 씻어냅니다.
정사각형 페트리 접시를 따뜻한 무대가 섭씨 38.5도로 설정된 스테레오스코프에 옮기고 배율을 1.25배에서 3.2배 사이로 설정합니다. 사각 페트리 접시에서 모낭을 확인한 후, 마이크로 피펫을 사용하여 모낭을 세척 배지 방울로 옮깁니다. 6분 조직 균질화를 사용하여 복제당 단리된 전-전-전-난포의 총 수는 11 내지 135개의 난포에 이르는 복제당 평균 41개의 난포를 나타낸다.
476 개의 분리 된 난포의 발달 단계를 평가 한 결과, 대다수가 발달의 주요 단계에 있었으며, 입방체 과립구 세포의 한 층을 포함하는 40-79 마이크로 미터를 측정했습니다. 6 분 동안 난소 피질의 균질화는 동일한 속도로 균질화의 5 분에 비해 더 많은 수의 전 개미 난포를 산출했다. 모낭에서 과립막 세포 마커 FSH 수용체 및 생식 세포 마커 DAZL의 전사체 발현은 역전사 정량 PCR을 사용하여 평가되었으며, 이는 1차 및 초기 2차 난포 모두 FSH 수용체 및 DAZL 전사체를 발현한다는 것을 입증합니다.
1 차 및 초기 2 차 단계에서 분리 된 전 전방 난포에서 CX37의 면역 형광 국소화는 CX37이 O 부위의 핵과 과립막 세포의 막에 부재 한 O 혈장에 국한되었음을 보여줍니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 피질 조직의 얇은 층을 적절하게 해부하고, 조직을 올바른 크기로 자르고, 적절한 균질화는 조직에서 생존 가능한 모낭의 방출을 보장하는 중요한 단계입니다. 분리 된 전 전방 난포는 전 전방 난포 성장 조절 및 과립구 세포와 난 모세포 간의 상호 작용의 특성과 같은 질문에 답하는 데 사용할 수있어보다 효율적인 배양 조건의 개발을 촉진합니다.
