우리의 프로토콜은 사용자 친화적입니다. 이 기술을 사용하면 누구나 혈액에서 성분을 쉽게 분리 할 수 있습니다. 오염을 최소화하고 재료를 정확하게 분리할 수 있습니다.
자동화 및 이 프로토콜의 확립으로 연구자들은 고순도의 암 관련 물질을 쉽게 얻을 수 있어 다양한 다운스트림 연구에 도움이 됩니다. 특히 최종 사용자 연구에 중요한 이점을 제공 할 것으로 기대됩니다. 그들의 절차를 시연하는 것은 암 유전체학 연구소의 선임 연구원이자 보조 관리자 인 Jay Jeong이 될 것입니다.
시작하려면 기기의 터치스크린 패널에서 카트리지 유형을 선택하여 LBx 1 카트리지를 로드합니다. 화살표 버튼을 눌러 샘플 수를 변경합니다. 그런 다음 기기 도어를 열고 사용할 모든 카트리지를 카트리지 홀더의 번호 순서대로 삽입합니다.
총 4개의 카트리지의 경우 카트리지 홀더의 빈 공간에 더미 카트리지를 놓습니다. 지지 휠을 사용하여 카트리지를 장착하고 잠금 너트를 조여 고정합니다. 도어를 닫고 터치패드 화면의 실행 버튼을 누릅니다.
기기는 카트리지의 밸브를 닫으며 약 30 초가 걸립니다. 메시지에 따라 문을 엽니다. 지지 휠을 제거하고 카트리지 홀더에서 밸브 폐쇄 카트리지를 제거합니다.
혈청 학적 피펫을 사용하여 최대 10 밀리리터의 전혈 샘플을 피펫팅합니다. 피펫 팁을 카트리지의 샘플 입구 깊숙이 삽입하고 전혈 샘플을 천천히 주입합니다. 카트리지를 기기에 삽입한 후 기기의 도어를 닫고 OK 버튼을 누릅니다.
혈장과 버피 코트는 전혈에서 자동으로 분리되며 약 30 분이 소요됩니다. 플라즈마와 버피 코트가 분리되면 알람 소리와 함께 화면에 메시지가 나타납니다. 도어를 열거나 정지 버튼을 눌러 알람을 중지하십시오.
문 여세요. 카트리지를 제거하고 테이블 위에 놓습니다. 1 밀리리터 피펫 팁을 사용하여 플라즈마 배출구에서 3 밀리리터의 혈장을 회수합니다.
그런 다음 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 버피 코트 배출구에서 버피 코트 3밀리리터를 회수합니다. 그런 다음 기기의 터치스크린 패널에서 카트리지 이름을 선택하여 LBx 2 카트리지를 로드합니다. 화살표 버튼을 눌러 샘플 수를 변경하고 LBx 1 카트리지에 표시된 것과 동일한 절차에 따라 카트리지 홀더에 카트리지를 삽입합니다.
카트리지를 삽입하고 도어를 닫은 후 터치패드 화면의 실행 버튼을 누릅니다. 앞에 표시된 절차에 따라 카트리지 홀더에서 밸브가 닫힌 카트리지를 제거하고 테이블 위에 놓습니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 밀도 구배 용액을 피펫팅한다.
피펫 팁을 카트리지 입구 깊숙이 삽입하고 용액을 천천히 주입하십시오. 그런 다음 전혈 샘플을 피펫팅하고 샘플 입구에 천천히 주입합니다. 카트리지를 삽입하고 고정한 후 도어를 닫고 OK 버튼을 누릅니다.
혈장과 PBMC가 전혈에서 자동으로 분리되면 경보음과 함께 메시지가 나타납니다. 도어를 열고 카트리지를 제거하십시오. 1 밀리리터 피펫 팁을 사용하여 혈장 배출구로부터 3 밀리리터의 혈장을 회수한 다음, PBMC 배출구로부터 3 밀리리터의 PBMC를 회수한다.
마찬가지로 FAST-auto 카트리지의 경우 카트리지 홀더에서 밸브 폐쇄 카트리지를 제거한 후 PBS 용액 6ml를 카트리지의 PBS 입구에 주입합니다. 이어서, LBx 1로부터 수득된 전혈 또는 버피코트 3 밀리리터, 또는 LBx 2로부터 수득된 PBMC 샘플을 피펫팅하고, 샘플을 카트리지의 샘플 입구에 천천히 주입한다. 카트리지를 삽입하고 고정한 후 도어를 닫고 OK 버튼을 누릅니다.
CTC의 자동 보강이 완료되면 경보를 중지합니다. 카트리지를 제거하고 백 플레이트 리무버 또는 BPR을 카트리지 전면의 구멍 4 개에 삽입합니다. 양손의 엄지 손가락으로 진한 파란색 날개를 누른 다음 딸깍 소리가 날 때까지 하늘색 몸체를 누릅니다.
카트리지 본체를 들어 올려 조심스럽게 제거하십시오. 핀셋을 사용하여 가장자리로 필터 멤브레인을 매우 부드럽게 들어 올리고 핵산 준비를 위해 멤브레인을 1.5 밀리리터 튜브에 넣거나 염색을 위해 슬라이드 유리에 놓습니다. 필요한 경우 여과 된 혈액을 1 밀리리터 피펫 팁을 사용하여 혈액 배출구로 회수하십시오.
추출된 cfDNA는 바이오분석기를 사용하여 평가하고, cfDNA 스크린 테이프를 전자 사다리와 함께 사용하였다. 녹색 선은 사다리와 샘플을 정렬하는 데 사용되었습니다. 삼각형 표시는 DNA 밴드를 나타냅니다.
대부분의 cfDNA는 길이가 166 염기쌍이고 일부는 정수의 배수로 존재합니다. 일반적으로 cfDNA의 농도는 최대 50-700 염기쌍의 크기를 측정합니다. 밀리리터당 8.47나노그램 및 밀리리터당 5.2나노그램과 같이 각 개별 샘플에서 얻은 양에는 차이가 있지만 cfDNA 추출 결과는 모든 경우에 농도와 크기 분포 모두에 양호했습니다.
이러한 결과는 LBx 1 방법이 cfDNA를 포함하는 혈장을 정확하게 분리한다는 것을 나타냅니다. FAST-auto에서는 막을 제거하고 형광 항체로 염색하여 CTC와 백혈구를 검출했습니다. 유리 슬라이드 위에 놓인 염색 된 멤브레인을 형광 현미경으로 관찰 하였다.
막 염색 후 세포는 DAPI 또는 핵 양성 신호를 파란색으로 표시하고 EpCAM 및 CK 또는 CTC 양성은 녹색으로 강조 표시되고 CD45 또는 WBC 양성은 빨간색으로 강조 표시됩니다. 멤브레인을 제거하는 것은 어렵지 않습니다. 그러나 CTC의 손실 및 오염에주의해야합니다.
전혈, PBMC 및 버피 코트를 모두 사용할 수 있습니다. 대신 전체 볼륨을 설정하기만 하면 됩니다. 테스트가 필요하지만 다른 액체도 사용할 수 있습니다.
이 기술은 병원에서 직접 수술 할 수 있으며 물질을 신속하게 얻을 수 있습니다.
