يمكن استخدام ثقافات الفحص 3D المعدلة لدينا للتحقيق في دور المكونات المختلفة في البيئة الدقيقة للسرطان ، مما يؤدي إلى تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة وأهداف الأدوية. تمكن هذه الطريقة المرء من دراسة التغيرات في النمط الظاهري الخلوي والإشارات الجزيئية التي تشبه إلى حد كبير الجهاز المناعي. ويمكن أيضا تعديله لتلبية المتطلبات المحددة للدراسة.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة التي يمكن أن تساعد في الكشف المبكر عن سرطان الثدي. أيضا ، يمكن استخدام الرؤى الجزيئية لتحديد أهداف الدواء الجديدة. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة كل من تكوين الورم وتكوين التشكل بعد اضطراب الجينات أو الجينات التي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الدور الذي يلعبه الجين أو الجينات.
للبدء ، التربسين الخلايا عن طريق شفط الوسط والغسيل مع 2 ملليلتر من PBS. أضف 900 ميكرولتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا أو حتى يتم تربسين الخلايا بالكامل. قم بإعداد سرير من lrECM في ثمانية آبار من شريحة زجاجية مغطاة بغرف عن طريق طلاء كل بئر ب 60 ميكرولتر من lrECM.
ضعه في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية لمدة أقصاها 15 دقيقة. لتحضير تعليق الخلية ، أضف 5 ملليلتر من وسط إعادة التعليق لإخماد نشاط التربسين وتدوير الخلايا عند 112 مرة جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. استنشاق الوسط المستنفد وإعادة تعليق الخلايا في 2 ملليلتر من وسط الفحص.
امزج التعليق جيدا لضمان تكوين تعليق خلية واحدة. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم واحسب حجم تعليق الخلايا اللازم لزرع 6000 خلية في كل بئر. وفقا لعدد الآبار المطلوبة ، قم بتخفيف تعليق الخلية في وسط التراكب.
أضف 400 ميكرولتر من تعليق الخلايا المخفف إلى أسرة lrECM المعدة بعناية ، مما يضمن بعناية عدم إزعاج سرير lrECM. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطوبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 3 ساعات ، أضف 200 نانومول من PAF إلى كل بئر.
أضف نفس تركيز PAF أثناء كل تغيير في الوسائط ، وقم بتجديد الخلايا بوسط طازج كل 4 أيام. بعد 20 يوما من الزراعة ، قم بإخراج الوسط بعناية من كل بئر واغسل الآبار ب 400 ميكرولتر من PBS المسخن مسبقا. إصلاح هياكل acinar عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد الطازجة واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
شطف الآبار مرة واحدة مع PBS الباردة الجليد وتتخلل مع PBS تحتوي على 0.5٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد 10 دقائق ، قم بإخراج محلول Triton X-100 بعناية وشطفه ب 400 ميكرولتر من جليسين PBS الطازج. أضف 400 ميكرولتر من محلول الحجب الأساسي الذي يتكون من مصل الماعز بنسبة 10٪ في مخزن مؤقت للتألق المناعي واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
قم بإزالة محلول الحجب الأولي ، وأضف 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة المانعة الثانوية بنسبة 2٪ المحضرة في محلول الحجب الأولي ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 إلى 60 دقيقة. تحضير الجسم المضاد الأولي في محلول الأجسام المضادة المانعة الثانوية بنسبة 2٪ في تخفيف 1:100. قم بإزالة محلول الحجب الثانوي ، وأضف الجسم المضاد المحضر حديثا ، واحتضنه بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
ماصة بعناية محلول الأجسام المضادة الأولية وغسله ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتألق المناعي. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف 1:200 للجسم المضاد الثانوي المترافق مع الفلوروفور في محلول الحجب الأولي واحتضان الشرائح في محلول الأجسام المضادة الثانوي لمدة 40 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اشطف الشرائح ب 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتألق المناعي لمدة 20 دقيقة ، يليه غسلتان باستخدام PBS لمدة 10 دقائق لكل منهما.
قم بتلطيخ النوى باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.5 نانوغرام لكل ملليلتر من البقعة النووية لمدة 5 إلى 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 400 ميكرولتر من PBS لإزالة البقعة الزائدة. قم بإخراج PBS بالكامل بعناية وتأكد من إزالة المحلول المتبقي.
ثم أضف قطرة واحدة من كاشف التركيب في كل بئر واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. وأخيرا، قم بتصوير الشرائح تحت تكبير 40x أو 63x على مجهر متحد البؤرة، مع أخذ مقاطع Z بصرية بحجم خطوة 0.6 ملليمتر. تمثل الصور نوى الخلايا في الأسيني الملطخة ببقعة نووية.
يتم عرض البناء ثلاثي الأبعاد للأسيني وصورة تباين المرحلة ل MCF10A acini المزروعة على lrECM لمدة 20 يوما هنا. يظهر القسم الأوسط وجود تجويف مجوف. PAF يعطل القطبية ويحفز التغيرات الشبيهة ب EMT في MCF10A الثدي acini.
نمت خلايا MCF10A كخلايا ثلاثية الأبعاد في الثقافات العليا في lrECM. تم التعامل مع الثقافات مع PAF في اليوم 0 و 4 و 8 و 12 و 16. تم الحفاظ على الثقافات لمدة 20 يوما ثم تم تلطيخ مناعيتها ل alpha6-integrin والبقع النووية ، GM130 ، وهي علامة للقطبية القمية ، و Vimentin ، علامة EMT.
تم عرض المكدس المركزي لل acini المعني هنا. البيانات التمثيلية هي ل 40-50 acini من ثلاث تجارب مستقلة بيولوجيا. يجب أن يكون سرير lrECM مصنوعا بعناية بحيث ينتشر بالتساوي دون أي فقاعات هواء.
أيضا ، يجب خلط تعليق الخلية بالتساوي وإضافته ببطء لتجنب التكتل. يمكن للمرء الحصول على البروتين والحمض النووي الريبي من ثقافات 3D التي يمكن استخدامها بعد ذلك للتحقيق في المسارات الجزيئية المختلفة.
