이 고처리량 분석은 caenorhabditis dauer 유충에서 강력한 중력 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 웜 거동은 페트리 접시에서 수행 된 분석과 비교하여 먼 거리에서 관찰됩니다. 이를 통해 분석의 감도가 향상되고 상세한 데이터 분석이 가능합니다.
중력 행동을 연구하면 포유류의 전정 시스템을 이해하는 것과 관련이있는 caenorhabditis에서 중력 감각이 어떻게 발생하는지에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 중력 분석 챔버를 만들고, 다우어를 분리하고, 웜을 챔버에 주입하는 것은 연습이 필요합니다. dauers를 격리하고 하루 전에 챔버를 만들어 시간을 절약 할 수 있습니다.
분젠 버너, 면도날 1-2개, 펜치, 핀셋, 플라스틱 절단 표면, 흄 후드를 설정하는 것으로 시작합니다. 챔버를 만들려면 두 개의 5 밀리리터 혈청 학적 피펫을 모으고 핀셋으로 하나의 피펫에서면 플러그를 제거하십시오. 분젠 버너 위에 펜치를 사용하여 면도날을 뜨거울 때까지 잡습니다.
가열된 블레이드를 사용하여 두 번째 피펫의 테이퍼 끝을 잘라 전체 피펫의 직경이 균일하도록 합니다. 이제 두 개의 수정된 피펫 끝을 화염에 빠르게 가까이 가져와 약간 녹입니다. 이 끝을 단단히 눌러 결합하여 두 피펫의 벽이 연속적이되도록합니다.
조인 후 간격이 보이면 간격을 분리하고 이 단계를 반복합니다. 표준 웜 절차에 따라 4%한천으로 NGM을 준비하고 한천이 아직 녹은 상태에서 혈청학적 피피터에 부착하여 각 챔버를 채웁니다. 고르지 않은 냉각으로 인한 한천의 일관성 변화를 최소화하려면 한천을 그리는 동안 배관공을 벤치 상단과 평행하게 잡으십시오.
그런 다음 천천히 용액을 뽑고 피펫터에서 챔버를 제거하기 전에 파라필름으로 팁을 밀봉합니다. 챔버를 평평하게 놓아 식히고 움직이기 전에 한천이 굳도록 합니다. 냉각되면 분젠 버너 위에 3mm 육각 키를 가열하고 정중선의 한쪽으로 약 5mm 떨어진 각 챔버의 벽에 단단히 눌러 작은 플라스틱 구멍을 만듭니다.
다음으로, 가열 된 블레이드를 사용하여면과 챔버의 테이퍼 진 끝을 제거하고 끝을 파라핀 필름으로 밀봉하십시오. 실험 10-15일 전에 각 균주를 OP50 박테리아가 있는 2-3개의 큰 NGM 플레이트에 덩어리로 만들고 파라핀 필름을 감쌉니다. M9 버퍼로 뚜껑과 플레이트를 헹구고 용액을 15밀리리터 원심분리 튜브에 피펫팅하여 벌레를 수집합니다.
실온에서 30-60초 동안 1600 x G에서 회전하여 벌레를 펠릿화하고 대부분의 M9 버퍼를 피펫 또는 진공 흡인기로 흡입합니다. 각 웜 펠릿에 1 % 나트륨 도데 실 설페이트 용액 7 밀리리터를 넣고 웜을 30 분 동안 그대로 두십시오. 폭기를 허용하려면 이 시간 동안 튜브를 계속 회전시키십시오.
그런 다음 M9로 3-5 회 헹구어 세제를 제거하십시오. 5 밀리리터 M9를 첨가 한 후, 5 밀리리터의 냉간 여과 된 60 % 자당 용액을 첨가한다. 철저히 혼합하고 실온에서 5분 동안 1600 x G에서 원심분리하여 분리 구배를 만듭니다. 새 15 밀리리터 원심 분리기 튜브에 2 밀리리터의 M9 버퍼를 채 웁니다.
이제 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 부수어 구멍을 넓 힙니다. 그리고이 피펫을 사용하여 용액의 최상층을 자당 구배에서 새 튜브로 옮깁니다. M9 버퍼로 다우어를 3-5회 헹굽니다.
실온에서 5 분 동안 1600 x G에서 원심 분리하고 피펫 또는 진공 흡인기로 대부분의 M9 용액을 흡인합니다. 다음으로, 해부 현미경으로 3개의 개별 1마이크로리터 방울에 있는 벌레의 수를 수동으로 계산하여 벌레 밀도를 추정하고 이러한 수의 평균을 사용하여 마이크로리터당 벌레 수를 근사화합니다. 이제 10, 20 또는 200마이크로리터 피펫 팁의 끝을 절단하여 팁 보어를 넓힙니다.
마이크로 피펫을 의도 된 흡인 부피보다 약간 큰 부피로 설정하십시오. 약 1-2 마이크로 리터의 농축 된 웜 용액을 흡입하고 소량의 공기가 팁으로 들어가도록합니다. 마이크로 피펫을 누르면서 피펫 팁을 한천에 부드럽게 밀어 넣습니다.
이렇게하면 팁이 막히지 않고 주사 부위가 생성됩니다. 웜을 한천에 넣고 파라핀 필름을 사용하여 개구부를 밀봉하십시오. 챔버를 실온의 어두운 패러데이 케이지 안에 넣은 후 가능한 한 많은 변수를 제거하려면 각 챔버에 레이블을 지정하고 패러데이 케이지 내에 수직으로 걸어 놓습니다.
동일한 환경 조건 내에서 일부 챔버를 평평하게 놓아 수평 제어를 동시에 테스트합니다. 그런 다음 수직 배향 N2 웜을 양성 대조군으로 사용하고 N2 다우어를 포함하는 수평 배향 챔버를 실험 균주에 대한 추가 음성 대조군으로 사용합니다. 몇 시간 후, dauer 웜은 시작 사이트에서 분산되기 시작하고 챔버의 양쪽 끝에 도달하는 데 몇 시간이 걸립니다.
이 시간 동안 챔버를 방해하지 않고 주사 후 12-24 시간 이내에 점수를 매기십시오. 다음으로, 챔버를 한 번에 하나씩 제거하고 해부 현미경으로 살아있는 다우어를 찾고 잉크로 위치를 표시하여 중력을 채점합니다. 주사 부위의 양쪽으로 2.5cm 이내의 웜은 방향 선호도를 나타낼 가능성이 없으므로 점수를 매기지 마십시오.
또한 죽은 것처럼 보이거나 액체에 갇힌 웜을 피하고 50 % 이상 죽은 또는 수영 웜이 포함 된 챔버를 폐기하십시오. 결과를 정량화하려면 마커를 사용하여 챔버의 각 절반을 주사 부위에서 2.5cm 떨어진 곳에서 시작하여 7 개의 3.5cm로 나눕니다. 수동 집계 카운터를 사용하여 각 섹션에서 관찰된 웜 수를 집계합니다.
caenorhabditis briggsae에서, 많은 비율의 dauer 벌레가 챔버의 상단으로 이동하는 것으로 나타났습니다. 그러나 수평 대조군은 챔버 중심 주변의 분포를 보여 부정적인 중력 거동을 나타냅니다. 또한, caenorhabditis briggsae와 caenorhabditis elegans의 수직 분포는 어떠한 차이도 나타내지 않았으며, 이는 caenorhabditis briggsae dauers가 caenorhabditis elegans dauers와 유사한 음의 중력 거동을 보인다는 것을 시사한다.
아지드화 나트륨과 같은 마비 작용제는 이 프로토콜에서 사용되지 않습니다. 따라서 중력실이 패러데이 케이지에서 제거되는 즉시 점수를 매기는 것이 중요합니다. 이 분석은 c.elegans에서 음의 중력 행동의 발견으로 이어졌습니다.
여러 돌연변이 균주를 테스트하여 웜의 중력에 대한 유전 적 및 신경 요구 사항도 밝혀 냈습니다.
