식물 세포 성장은 세포벽의 기계적 특성에 의해 제어됩니다. 따라서 식물의 다양한 기관과 조직에서 이러한 특성을 아는 것이 중요하다. 여기에 제시된 방법은 어린 식물의 내부 조직에서 고정되지 않은 세포벽과 탈수되지 않은 세포벽의 생체 역학적 특성을 허용합니다.
비브라톰 절단을 위한 솔루션과 샘플 준비부터 시작하십시오. 페트리 접시 바닥에 녹은 3%아가로스의 4mm 층을 붓고 샘플의 열 손상을 방지하기 위해 약간 식힙니다. 약 5 밀리미터 길이의 식물 기관 3-4 개를 아가 로스에 수평으로 놓습니다.
약 30 내지 60 초 후에, 얇은 반고체 필름이 첫 번째 아가 로스 층의 상부에 나타날 것이다. 그런 다음 조심스럽게 두 번째 레이어를 위에 붓습니다. 아가 로스가 완전히 응고 된 후, 시편이 들어있는 블록을 잘라냅니다.
블록을 육각형 잘린 피라미드로 만들어 추가 절단 중에 안정성을 보장합니다. 비브라톰으로 샘플 절단을 시작하기 전에 시아노아크릴레이트 접착제로 블록을 비브라톰 스테이지에 붙입니다. 피라미드 모서리 중 하나가 비브라톰의 날을 향하고 비브라톰 욕조에 물을 붓도록 무대를 비브라톰에 놓습니다.
단면 두께, 블레이드 속도 및 진동 빈도와 같은 단면 매개변수를 설정하고 샘플을 절단합니다. 가는 솔을 사용하여 수조에서 유리 슬라이드로 섹션을 옮기고 섹션 위에 물 한 방울을 놓아 건조를 방지합니다. 광학 현미경으로 단면의 품질을 확인한 후 단면 평면에 수직인 세포벽이 있는 적절한 단면을 선택합니다.
그런 다음 피펫을 사용하여 페트리 접시 캡의 바닥에 1 % 용융 아가 로스 1 밀리리터 층을 부어 원자력 현미경 측정을위한 섹션을 고정시킵니다. 아가 로스가 고형화 된 후 여과지를 가장자리로 가져와 섹션에서 과도한 물을 제거하십시오. 브러시를 사용하여 슬라이드에서 페트리 접시 캡의 중앙으로 섹션을 조심스럽게 옮깁니다.
그런 다음 20 마이크로 리터 피펫을 사용하여 섹션 주위에 1 % 아가 로스를 조심스럽게 추가하고 원자력 현미경 검사를위한 물 또는 기타 용액을 고정 된 섹션이있는 페트리 접시 캡에 붓습니다. 광학 현미경을 사용하여 원자력 현미경 캔틸레버 아래에서 샘플을 안내합니다. 접근 버튼을 클릭한 다음 랜딩 버튼을 클릭하여 1나노암페어의 설정점으로 접촉 모드에서 샘플에 접근합니다.
스캔 버튼을 클릭 한 다음 영역 버튼을 클릭하십시오. 스캔할 영역 크기를 50마이크로미터 x 50마이크로미터로 선택합니다. Move Probe 버튼을 클릭하고 스캐너를 그 위로 이동하고 스캐너 돌출 정도에 따라 가장 높은 지점을 찾아 전체 스캔 영역을 확인합니다.
접근 탭을 엽니다. 그런 다음 제거 버튼을 클릭하여 샘플에서 철회합니다. 가장 높은 지점을 대상으로 사용하여 랜딩 버튼을 클릭하여 샘플에 다시 접근합니다.
그런 다음 Move Probe 버튼을 클릭하고 스캐너를 그 위로 이동하여 표면을 다시 확인하십시오. 스캔 속도를 0.5Hz로 설정하고 스캔 크기를 50마이크로미터 x 50마이크로미터로, 스캔 지점을 64 x 64로 설정합니다. 실행 버튼을 클릭하고 스캔하여 샘플 표면을 확인하면 아가로스로 오염될 수 있습니다.
On 버튼을 클릭한 후 프로그램 메인 창의 드롭다운 메뉴에서 HDPlus 모드를 선택하고 메인 프로그램 창에서 설정값을 0.1나노암페어로 설정합니다. HD 창의 기본 탭에서 연구된 샘플에 적합한 스캔 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 HD 창에서 소음 탭을 열고 캔틸레버의 공진 주파수를 입력합니다.
HD 창의 퀀트 탭을 열고 IOS, 캔틸레버 강성, 팁 반경 및 각도를 입력합니다. 팁 형상에 따라 계산에 사용할 접촉 모델을 선택합니다. 그런 다음 HD 창의 스캔 탭을 열고 신호와 신호가 기록되는 방향을 선택하십시오.
체크 힘 볼륨 상자를 클릭하여 모든 힘 곡선의 기록을 얻고 메인 프로그램 창 상단의 끄기 버튼을 클릭하여 피드백 루프를 켭니다. 메인 HD 창에서 위상 코어 버튼을 클릭하여 광학 시스템의 감도를 수정합니다. 메인 HD 창의 시간 대비 탭은 DFL 신호 대 시간의 기능을 실시간으로 표시합니다. 기준선 수준 결정에 사용하고 추가 계산을 위해 접촉 모델을 피팅하는 데 사용할 이 함수의 부품을 선택합니다.
이제 프로그램의 기본 창에서 스캔 포인트 값을 256 x 256으로 설정하십시오. 그런 다음 스캔 속도를 0.2Hz로 설정하고 실행 버튼을 클릭하여 샘플을 스캔합니다. 스캔이 중지되면 기본 창 상단의 On 버튼을 클릭하여 피드백 루프를 끕니다.
드롭다운 메뉴에서 접촉 모드를 선택하고 접근 탭을 연 다음 제거 버튼을 클릭하여 샘플에서 철회합니다. 데이터 버튼을 클릭하여 분석 소프트웨어를 열고 출력을 저장합니다. 분석 소프트웨어에서 저장된 파일을 엽니다.
HD 포스 볼륨 프레임을 선택합니다. Control 키를 누른 상태에서 동일한 스캔 방향으로 얻은 하나의 시각적 프레임을 선택합니다. 외부 맵 로드 버튼을 클릭하여 셀 벽이 어디에 있는지 확인합니다.
기본 탭에서 InvOptSens 및 캔틸레버 강성 값을 확인합니다. 추가 탭을 열고 팁 매개변수와 접촉 모델을 확인합니다. 시각적 프레임의 셀 벽에서 다양한 점을 클릭하고 모델에서 잘 설명한 곡선만 선택합니다.
모듈러스 맵의 흰색 영역은 스캐너가 Z 방향으로 한계에 도달하여 영률의 잘못된 과대 평가에 해당합니다. 이 이미지는 만족스러운 힘 곡선을 추가로 선택하기 위한 외부 맵으로 사용하기에 편리하지 않습니다. 그러나 오른쪽에 표시된 DFL 신호 맵이 여기에 더 적합합니다.
다른 계측기는 DFL 신호를 편향 또는 오류 신호로 참조할 수 있습니다. 샘플 바닥에 도달하려고 시도하는 동안 완전히 확장된 스캐너는 잘못된 측정과 스캔을 중단할 수 있습니다. 아가로스 존재는 접촉 모드에서 첫 번째 스캔을 획득하는 동안 세포벽 및 일부 세포 바닥이 이러한 스캔에서 볼 수 있으므로 확인할 수 있습니다.
그러나, 부정확 한 고정의 경우, 표면은 샘플 지형을 가리는 아가 로스로 덮일 수있다. 동일한 세포벽의 다른 지점에 기록된 4개의 서로 다른 힘 곡선 중에서 0.1로 기록된 곡선은 기준선을 나타내지 않으며, 이는 캔틸레버 팁이 세포벽에서 분리되지 않음을 의미합니다. 0.3으로 기록된 곡선은 세포벽의 굽힘을 나타내는 접근 부분의 숄더를 보여줍니다.
점 2와 4는 유사한 계수 값을 가진 만족스러운 힘 곡선을 보여줍니다. 샘플 준비 및 검사는 연습이 필요하지만 마스터 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 중요한 부분은 결과 곡선을 필터링하는 것입니다.
자동으로 계산 된 모듈리에 의존하지 마십시오. 동일한 기술을 사용하여 접착력 또는 에너지 소산을 측정할 수 있습니다. 또한 일부 재료의 점성 또는 점탄성 거동을 설명하는 데 중요 할 수 있습니다.
