우리가 그들의 지속적인 협력 A. Tager 및 B. 쉬어 감사하고, 여기에 데모 목적으로 사용되는 폐 조직을 제공. 이 작품은 건강 부여 HL - 092961 국립 연구소에 의해 지원되었다. 이 작품은 NSF 수상 항법 - 0,335,765 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원하는 Nanoscale 시스템 (CNS), 국립 나노기술 인프라 네트워크의 회원에 대한 센터에서 부분적으로 실시되었다. CNS는 하버드 대학에서 예술과 과학의 학부의 일부입니다.

1. 폐 조직 스트립 준비 <ol><li> 폐 조직은 고도로 규격 및 AFM 특성화를 위해 스트립으로 절단하기가 어렵습니다. transiently, 절삭에 대한 폐 구조를 안정화 2퍼센트 낮은 젤 포인트 아가로 오스 (PBS에서 준비) 50 ML / kg 체중과 intratracheally 고립 마우스 폐가 팽창하기 위해서는 37 ° C.에 예열 기관을 묶어 4에서 PBS의 목욕에있는 높게 폐가 멋진 ° C를 60 분. 아가로 오스는 젤 부드럽게이 간격 5시 폐 구조를 안정화하기 위해 airspaces에 굳어지다 것입니다. 높은 아가로 오스의 농도 즉, 3-4%는 추가 가공을 위해 조직 안정화를 향상하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 길이와 폭 5 X 5mm 두께 400 μm의의 스트립에 면도칼이나 메스 블레이드와 아가로 오스 - 안정화 마우스 폐 조직을 잘라 다음 37 미리 예열 PBS의 목욕에있는 스트립을 씻어 ° C 100 ML을 사용하여 잔류 아가로 오스를 제거하는 5 분간 벤치 - 최고 온수 저어 플레이트에 유리 비커. 대형 항공 및 선박을 제외하려면 주요 줄기 기관지에서 멀리 subpleural 지역에서 스트립을 잘라. 기도와 대형 선박이 몇 군데 수있다면, 주요 줄기 기관지 더 근위 폐 조직에서 스트립을 잘라. </li></ol> 2. AFM의 Microindentation 및 형광 이미징 <ol><li> AFM의 microindentation에 대한 관심 영역을 분리, 조직은 위상 콘트라스트 현미경에 의해 시각, 또는 immunostained 및 형광 현미경에 의해 시각하실 수 있습니다. immunostaining 들어, 실온에서 고정 또는 permeabilization없이 2 시간 동안 원하는 차 항체의 소스 (PBS)에서 혈청 5%와 조직에 부착된를 차단합니다. </li><li> 적절한 기본 항체와 조직 스트립을 품어 (예 : 토끼 전 지하 막을 시각화하기 위해 중간 콜라겐 (1:250 희석), 토끼 안티 laminin (1:250 희석)를 시각화하는 안티 - 콜라겐) 12 잘 판의 우물에 1 시간 동안 부드러운 떨고있는 락커에 1 형광 태그 (예 : 알렉사 플루어 546 염소 안티 - 토끼 보조 항체 (1:250 희석))에 복합 적절한 보조 항체 다음 5 분 PBS와 각 샘플 3 번이나 씻어 상온에서 시간. </li><li> 4 PBS에 PBS 및 저장과 광범위한 조직 스트립 와시 ° C </li><li> 즉시 AFM 특성화하기 전에, 부동 조직 아래에서 coverslip을 운반 조직 스트립이 coverslip 표면에 균일하게 확산 확인함으로써 폴리 - L - 라이신 - 코팅 15 mm coverslip으로 조직 스트립을 장착, 필요한 경우, 샌드위치 스트립 두 번째 깨끗한와 coverslip을 uncoated 및 폴리 - L - 라이신 - 코팅 coverslip으로 조직 첨부 파일과 함께 지원하는 가벼운 압력을 적용합니다. </li><li> microindentation 실험의 각 라운드 바로 앞에 제조의 지시에 따라 AFM 시스템을 보정합니다. ; 실제 캔틸레버 편향 거리에 photodiode 출력 신호를 확장하는 데 사용하는 매개 변수이며, 2) 캔틸레버 편향 감도, Δd 1) 캔틸레버 공기 6 열 변동의 방법을 사용하여 스프링 정수 두 가지 중요한 매개 변수를 확인합니다. 다음 힘 - 변위 곡선 (Fig.1B)의 기울기를 계산 깨끗한 유리 슬라이드에 PBS에서 표준 힘 - 변위 곡선을 얻어 편향 감도를 보정합니다. 팁 변위, Δz의 함수로 모니터 캔틸레버의 편향, Δd와, 힘 - 변위 곡선 측정에서 AFM 팁는쪽으로 확장하고 단일 위치에서 시료 표면 (XY 방향으로 rastering없이)에서 철회 . </li></ol> 우리는 5 μm의 직경 borosilicate 구형 팁 (Novascan)과 실리콘 질화물 삼각형 캔틸레버를 사용하는 것이 좋습니다. 0.06 N / m의 상수 온천과 AFM 프로브를 사용하여, 우리는 기계적 전단 moduli 50,000 PA에 100을 스팬와 부드러운 소재를 특징있다. <ol start="6"><li> 조직 종이로 샘플 coverslip 하단의 표면을 닦고, 진공 그리스와 표준 유리 슬라이드에 고정 AFM 샘플 단계에있는 유리 슬라이드를 탑재, 500 μl PBS (상온)로 조직을 커버. </li><li> 현미경 샘플 단계를 조정하여보기의 필드의 중앙에 AFM 팁 정렬하는 눈 - 피스 볼 수있는 현미경을 설정합니다. AFM 샘플 스테이지를 이동하여 조직에 대한 관심의 영역을 선택한 다음, 원하는대로, 위상 콘트라스트 이미지 및 / 또는 조직의 형광 이미지를 기록보기 CCD 카메라로 전환합니다. </li><li> 이 샘플과 접촉 때까지 천천히 아래쪽으로 AFM 팁을 이동하여 표준 AFM의 결합 작업을 수행합니다. </li><li> 부드러운 샘플 정확한 AFM의 microindentation 특성화 작은 압입 깊이가 탄성 계수 계산에 사용되는 헤르츠 모델을 무효화 대규모 지역 긴장을 피하기 위해 필요합니다. 대형 변종을 피하기 위해, 500 nm의로 캔틸레버 최대 편향 (트리거 포인트)을 설정하여 트리거 모드에서 들여쓰기를 수행합니다. 이 편향 제한을 억제합니다최대 압입 강제로 30 NN (F = 캔틸레버 스프링 상수 * 변위, 또는 F 최대 = 0.06 NN / NM * 500 NM = 30 NN). </li></ol> 압입 속도는 부드러운 샘플 7 탄성 오히려 점탄성 특성을 탐구하기 위해 충분히 속도로 선정한다. 초당 20-20 μm의의 속도 범위는 폐 조직에 적합합니다. <ol start="10"><li> 관심 영역에서 하나의 측정에 대한 관심의 위치에 AFM의 프로브를 이동하고 표준 힘 - 변위 곡선을 (탐사선이 XY 스캔하지 않고 Z - 방향으로 이동) 수집하는 하나의 들여쓰기를 수행합니다. </li><li> 관심 영역의 자동 매핑 들어, 강제 맵 모드로 전환 선택한 지역 스캔 크기 및 샘플 포인트를 선택합니다. 포스 -지도 모드에서 AFM 팁 들여쓰기 변동 사이의 시료 표면에 걸쳐 rasters하고 정의된 샘플 격자 내의 각 지점에서 개인 힘 - 변위 곡선을 수집합니다. 더 많은 샘플링 지점은 높은 공간 해상도를 제공하지만, 매핑에 필요한 시간을 길게합니다. 우리는 실천 ~ 10 분 이내에 완료할 수 초 당 20 μm의의 들여쓰기 속도에서 80 X 80 μm의 영역을지도로 16 x 16 픽셀의 샘플 격자를 사용하여 발견했습니다. </li></ol> 3. AFM 데이터 추출 <ol><li> 의 영 계수를 계산하기 위해 최소 제곱 비선형 휘었 피팅 8 (Fig.1 A, C)를 사용하여 헤르츠 구면 들여쓰기 모델 힘 - 변위 곡선에 맞게 : <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="방정식 1" /> 어디 F = K C * Δ D는 캔틸레버을 휘게하는 힘이있다, K C는 상수 캔틸레버 온천, R은 둥근 팁 반경이며, δ = Δ Z - Δ D는 들여쓰기입니다 υ는 샘플 포이슨 비율 (는 υ = 폐 조직 9 0.4). </li><li> 적합의 품질을 평가하기 위해, 비선형 곡선 피팅 동안 SSR 값, 또는 데이터와 맞지 값 사이의 차이의 제곱의 합계를 계산합니다. 대형 SSR 값 &quot;나쁜&quot;곡선에서 폐기 데이터가 신뢰할하거나 선택을 취소 interpretable 측정을 제거합니다. </li><li> 원하는 경우, 관계를 이용하여 전단 계수 (G)로 탄성 계수 (E)를 변환 E = 2 X (1 + υ) × G.는, 등고선지도의 줄거리 계수 데이터를 강제로지도 모드에서 수집한 강성의 공간적 패턴을 시각화하는 (16 x 16 픽셀의 샘플 격자의 예는 80 X 80 μm의 영역을 커버). </li><li> 힘 곡선 데이터의 대량를 처리하기 위해 사용자 지정 알고리즘을 자동으로 3.2 3.3 (예 : Matlab)에 명시된 바와 같이 동일한 절차와 매개 변수를 사용하여 힘 - 변위 곡선, 추출 moduli 및 / 또는 플롯 elastographs에 맞게 기록될 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 (A) 구형 프로브를 (Dimitriadis E., 외. 2002 Biophys J 8 허가를 재현)를 사용하여 단단한 기판에 부드러운 시료의 AFM의 microindentation의 도식. (B) 대표 힘 - 변위 곡선은 캔틸레버 편향 감도를 결정하기 위해 PBS에 깨끗한 유리 슬라이드에서 수집했습니다. (C) 대표 힘 - 변위 곡선 (A)에서 해당 매개 변수를 보여주는 소프트 (파란색)과 치열한 (적색) 샘플에서 수집했습니다. 4. 대표 결과 : 그림 2A 직접 관심 지역의 위 장소에서 AFM 프로브와 PBS에서 폴리 - L - 라이신 코팅 coverslip에 부착하고 microindentation 매핑 준비 폐 실질 조직의 스트립을 보여줍니다. 그림 2B 제대로 자르고 스테인드 조직에서 폐 실질 조직의 폐포 마이크로 아키텍처는 물론 고정 또는 permeabilization없이 지하 막 구성 요소 laminin에 대한 immunofluorescent 얼룩에 의해 관찰, 보존는 것을 보여줍니다. 콜라겐 섬유증 10 유도 이전에 PBS (그림 2C)로 치료 생쥐에서 수확하거나, bleomycin (그림 2D)로 치료 신선한 떼어낸 폐 속에서 위해 그림 2 CD 쇼 immunofluorescent 얼룩. 그림 3A는 AFM의 microindentation에서 얻은 샘플 힘 - 변위 플롯을 보여줍니다. 동일한 응용 강제로 AFM 팁은 (stiffer 지역을위한 작은 들여쓰기와 &quot;가파른&quot;힘 - 변위 곡선 비교 상대적으로 &quot;평면&quot;힘 - 변위 곡선의 결과, 부드러운 영역 (파란색 선)에 큰 굴곡을 생성 레드 라인). 깨끗한 힘 곡선을 얻기 위해서는 각 들여쓰기 후 AFM 팁은 다음 들여쓰기하기 전에 샘플 표면과 접촉에서 무료로 완전히 철회해야합니다. 이 연락처 프리 스테이트는 끝 캔틸레버 편향없이 변환 그림 3A에서 곡선의 평평한 지역에 해당합니다. 그림 3B는 팁 완전히 샘플 표면에서 철회하지 않을 경우 (예 : 소프트 샘플 발생하는 평평한 지역이없는 전형적인 허위 곡선을 보여줍니다팁)는 불가능 접촉 지점을 결정하기 위해 만들기 위해 ttaches. 팁이 완전히 부드러운 샘플에 갇혀있다면, 곡선은 분명 편향하지만 작은 노이즈없이 그림 3C와 같이 보일 수 있습니다. 그림 4는 강성지도 (elastographs), 전단 계수와 컬러 비늘 같은 공간 표시 힘 - 변위 곡선에서 추출한 전단 계수 데이터를 보여줍니다. Elastographs 특히 fibrotic 폐 샘플 내에 인상적인 정상의 범위와 조직 전단 계수의 분포의 차이 (그림 4A)과 fibrotic (그림 4B) 폐 실질 조직 및 전단 계수에 큰 공간적 변화를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 마우스 폐 실질 스트립 이상의 AFM 프로브를 보여주는 (A) 위상 콘트라스트 현미경. 스케일 바, 50 μm의. (B) 일반적인 마우스의 폐 조직에서 laminin의 Immunostaining 정상 폐 실질 조직의 폐포 마이크로 아키텍처를 보여주는. 화이트 박스는 전형적인 80 - 80μm의 탄성 매핑 영역을 나타냅니다. 스케일 바 : 20 μm의. 생리 (C) 및 bleomycin (D) 치료를 마우스 폐 실질 조직의 콜라겐 I을의 (C 및 D) Immunostaining. 스케일 바, 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. (A) 대표 interpretable 힘 - 변위 곡선은 각각 호수 (파란색)과 bleomycin - 대우 (적색) 마우스 폐 실질 조직에서 수집했습니다. 블랙 라인은 구면 헤르츠 모델에서 발생하는 가장 적합하고 해당 계산 영 moduli으로 표시됩니다. (B, C) 대표 취소 interpretable 힘 - 변위 곡선. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 호수 (A)와 bleomycin - 대우 (B) 마우스 폐 실질 조직에서 수집한 대표 elastographs. 색상 막대 kilopascals의 전단 계수를 나타냅니다. 축 라벨 micrometers의 공간적 스케일을 나타냅니다. 스케일 바 : 20 μm의

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

AFM의 microindentation를 사용하여 폐 조직의 기계적 특성은 조직 경직에 microscale 변화에 대한 독특한 시각을 제공 전례 공간 해상도 (그림 4) 제공합니다. 그 유틸리티의 예를 들어, 정상 및 fibrotic 폐 조직 스트립에서 이전 매크로 규모 측정 섬유증 11,12와 elastance에서 대략 2 - 3 - 배 증가 지적했다. 반대로, AFM의 microindentation는 조직 stiffening 일부 지역은 정상적인 폐 조직 10 관찰 평균 이상의 전단 계수에 ~ 30 배 증가 최대 전시와 함께, 매우화된입니다 보여줍니다. 매트릭스 강성 이제 비판적으로 세포 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으므로,이 지역의 측정은 폐암 세포의 세포 배양 연구의 biofidelity을 향상시킬 소중한 매개 변수를 제공합니다. 몇 가지 실질적인 문제는 폐 조직의 얇은 스트립를 사용하여 발생. 조직 프로필은 기본 폐포의 구조를 다음과 같이 스트립의 표면은 완벽하게 평평하지 않습니다. 샘플 표면 높이 변화가이 도전을 극복할 수 있도록 15 μm의보다 작은 경우 AFM 시스템은 자동으로 들여쓰기 동안 Z - 방향으로 끝 위치를 조정합니다. 측정은 실온이 아닌 37 ° C에서 만들어진, 그래서 그들은 사소한 것으로 예상 것입니다하지만 온도에 변화에 의한 기계적 특성의 편차는 평가할 수 없습니다. 관찰 기계적 성질에 대한 기본 폐포 벽 구조의 영향력은 현재의 광 현미경 설치와 확인하기 어렵습니다. 예를 들어, 그것은에 부합하거나 벽 비행기에 가로 방향으로 패인 때 폐포 벽은 이방성 및 다른 기계적 특성을 전시 있는지 확인하는 것이 바람직하다 것입니다. 그러나, 현재의 표본은 두꺼운되고 이미징 시스템은 그러므로 그것이 접촉의 각 지점에서 현지 폐포 벽을 방향을 결정하는 것은 불가능합니다, 3D 기능을 가지고 있지 않습니다. 마지막으로, 측정된 기계적 성질에 대한 세포 성분의 영향을 완전히 elucidated로 남아 있습니다. 여기에 설명된 방법에 어떤 노력을 구체적으로 조직의 세포 성분을 제거하기 위해 만든되지 않습니다. 그러나, 세포가 들여쓰기에 사용할 수있는 표면에서 현재는 조직 수확 및 폐포에 액세스할 수있는 조직을 절삭의 필요성 이후의 경과 시간이 주어 가능한 것으로 않을 수 있습니다. 세포를 제거하거나 실용적 세포와 매트릭스를 repopulate하고, 조직 강성의 결과 변화를 평가하기 위해 특정 실험 보증 나타납니다. 신선한 떼어낸 조직은 이러한 측정이 필요하기 때문에, 측정하기 위해 조직 수확의 경과 시간은 최소화되어야하며 샘플 ° C가 기계적 성질의 변화를 피하기 위해 4 저장해야합니다. 조직 스트립은 세척하거나 최소한 왜곡 또는 손상이 생성되도록 얼룩 때 컨테이너간에 전송됩니다 때마다 특별한 관심을 지불하여야한다. 액체의 AFM 응용 프로그램의 경우, 중요한 단계는 가능한 한 평평하게 조직을 잘라 지원 coverslip에 샘플을 고정하는 것입니다. 가능한 경우, vibratome 또는 조직 슬라이 같은 자동 sectioning 기계는 매우 균일한 두께의 조각 절단하는 데 사용할 수 있습니다. AFM 측정 직전 조직 스트립을 첨부하여 예제는 결국 coverslips에서 분리하므로 AFM 측정 경과 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 하나의 유용한 관찰 큰 스트립이 전표를 커버하고 작은 스트립보다 PBS에서 더 이상 기간이 위해 장소에 남아보다 안정적으로 부착하는 표시이다. AFM의 microindentation는 5 μm의 직경 구형 팁있는 표준 0.06 N / m의 캔틸레버를 사용하는 경우 100 파 50 kPa (전단 계수)에 광범위한 스패닝 샘플을 특징하실 수 있습니다. 0.01에서 0.58 N / m에 이르는 직경 봄 상수의 0.6-12 μm의에서 상용 (예 : Novascan) 및 일반적으로 3 사용 범위 구형 유리 팁을 AFM 프로브,이 범위가 다른 스프링 상수와 프로브를 사용하여 확장하실 수 있습니다. 5 μm의 구형 팁으로, 팁 및 조직 사이의 이론적인 접촉 면적은 400-700 나노미터 들여쓰기 (그림 1A)에 대한 5-9에 대한 μm의 2입니다. 작은 또는 큰 팁은 공간 해상도 작은 또는 큰 스케일을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 피라미드 팁 또한 작은 접촉 영역을 제공하기 때문에 데이터 피팅이 팁 도형에 대한 더 복잡하지만, 매핑의 공간 해상도를 증가 AFM의 microindentation 13-16에 사용되었습니다. 이 방법은 몇 가지 한계가 주목하여야한다. 폐는 전통적으로 기계 압력 볼륨 분석 17 전체 폐의 ​​펀치 - 들여쓰기 19,20를 사용하는 예를 들어, 비 invasively 특징되었습니다. 같은 공기 - 액체 INT의 상실을 통해 중요한 방법으로 폐 아키텍처를 변경 여기에서 설명한 것과 침입 방법일반적으로 공기 주입 폐 및 호흡기 근육의 이완에 따라 폐 부분 인플레이션을 유지 미리 스트레스의 손실 존재 erface. 이러한 제한은 폐 조직에 부착된 18 만든 모든 측정에 공통적으로하고 있습니다. 특히, 그러나, 평균 강성 쉬고 볼륨 19,20에서 그대로 폐의 펀치 - 들여쓰기를 기반으로 견적에서 크게 차이가없는 정상적인 폐 조직의 실질 (전단 계수가 ~ 0.5kPa)에서 측정. 폐 조직이 증가하는 변형과 비선형 stiffening을 전시하는 것으로 알려져 있지만,이 속성이 여기에 사용된 방법과 마이크로 규모로 지속 여부를 엄격한 방식으로 테스트하는 것은 불가능합니다. 헤르츠 모델은 샘플의 균질성을 가정합니다. 그러나, 폐 실질을 포함한 대부분의 생물 학적 물질, 공간 비늘 감소에 점점 더 이질 있습니다. 샘플의 이질는 IE deforming있는 레이어 또는 구성 요소에 따라 들여쓰기 깊이에 따라 영 계수의 변화와 같은 유물이 발생할 수 있습니다. XY - 비행기의 이질은 신중로 Dimitriadis EK 외 제안한 biomaterial의 미세에 따라 적절한 구면 팁 크기를 선택하여 제한될 수 있습니다. 8 그것은 소재로 인해 헤르츠 모델 오류를 예측하거나 해결하기 위해 훨씬 더 큰 어려움입니다 Z - 방향으로 이질. Azeloglu 외. 최근 이산 임베디드 흠도 21 이기종 기판의 탄성 특성을 특징으로 하이브리드 컴퓨팅 모델을 제안했습니다. 그들의 새로운 기술은 잠재력이 Hertzian 분석의 한계를 극복 이종 재료의 포함 속성을 계산하는 방법을 제공합니다. 생물 학적 물질은 일반적으로 시간에 의존 점탄성 동작을 표시하면서 헤르츠 모델도 절대 탄성 동작을 가정합니다. 조직 전체 점탄성 특성을 사용 들여쓰기 판매율 변화하여 얻을 수 있습니다. 중요한 것은, 정상 및 fibrotic 폐 조직의 이전 매크로 규모의 기계 테스트가 약한 주파수 폐 조직 기계적 성질의 의존성, 그리고 주파수에 걸쳐 정상과 fibrotic 조직 기계적 성질의 차이의 보존을 보여 11 테스트. 이러한 결과는 강력 AFM과 함께 하나의 들여쓰기 속도를 사용하여 기계적 성질의 측정 섬유증을 동반 조직 기계적 성질의 변화의 핵심 부분을 캡처하는 것이 좋습니다. 이 작품에 사용되는 폐 조직에 대한 0.4의 포이슨의 비율은 매크로 측정 9 시부터입니다. 불행히도, 포이슨의 마이크로 규모 비율과 질병 상태에 따라 어떤 변화가 문학에서 사용할 수 없습니다. E, E / (1 ​​- υ 2) 또는 (1 - υ 2) / πE에 대한 대안이 (탄성 상수 K를 표시됨)으로 22 AFM의 microindentation에서 계산하고 포이슨의 비율이 알 수없는 경우 신고하실 수 있습니다. 대부분의 biomaterials에 대한 포이슨의 비율은 높은 수분 함량으로 인해 0.4-0.5의 범위에 있습니다. 범위 0.3-0.5 내에서 요소 1 / (1 ​​- υ 2) 포이슨의 비율에 합리적인 변화가 보고된 계수에 대해서만 효과를 발휘 겸손한 이러한 단 1.10-1.33부터 다릅니다. 우리가 정상 조직에 fibrotic 조직 친척보고 그 전단 계수의 증가 포이슨의 비율 변화와 관련된 오류가 관찰 기계적 성질의 변화에​​ 사소한 상대한다는 뜻인, 진도 몇 배입니다. 힘 - 변위 데이터의 분석에 사용할 수있는 실제 알고리즘과 코드는 특정 응용 프로그램 상태와 힘 - 변위 곡선의 다양한 인구의 후속 특성에 따라 달라질 수 있습니다. 보다 정교한 분석 관심있다면, 하나는 린 외의 작품을 참조 수 있습니다. 23. 저자는 이전에 들여쓰기 데이터 헤르츠 모델의 피팅을 자동화하는 노력을 장애가있는 합병증 중 많은 것들을 극복 알고리즘에 시너지 전략 일련의 컴파일. 여러 다른 지역이 방법의 발전과 개발에 사용할 수 있습니다. 한 항체 라벨없이 폐포 벽을 시각화에 관심이있는 경우에는, 엘라스틴과 콜라겐 모두 녹색 스펙트럼에서 autofluorescent 신호로부터 시각하실 수 있습니다. 반면에, 얇은 조직 섹션, 3D 이미징 기술, 또는 둘 모두를 사용하여 더 나은 영상은, 기계적 특성을 기본과 조직 구조를 상호 연관시킬 수있는 능력을 향상시킬 수 있습니다. 현재 방법 등 콜라겐과 laminin과 같은 세포외 기질 구성 요소의 얼룩과 시각화 수 있지만, 추가적인 노력은 특정 세포 집단을 식별하고 이러한 인구의 주변에있는 기계 microenvironments을 특성화하기 위해 세포 표면 마커를 얼룩 목표로 수 있습니다. 알트ernatively, 조직이 동일한 목표를 추구하는 마커 또는 셀 특정 단백질 혈통 찬란 - 태그를 표현 생쥐에서 수확 수 있습니다. 마지막 방법은 여기에 잘 개조 등 천식의 리모델링 고혈압의 선박 및 항공로, 폐의 다른 해부 학적 기능을 특성화에 맞는 세부 나타납니다. 더욱 강화 개발 및 잠재 자사의 현재 상태를 기반으로, AFM의 microindentation은 폐에 질병의 진행과 함께 조직의 강성의 변화에​​ 귀중한 통찰력을 얻을 태세를 표시하지 않으며 아무의 공간 및 시간적 변화를 특성화에 가치가 의심됩니다 다른 부드러운 조직의 다양한 강성.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> AFM 팁 </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 미크론 Borosilicate 구슬, 0.06 N / m </td></tr><tr><td> 폴리 - L - 라이신의 coverslips </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12mm 라운드 제일 유리 </td></tr><tr><td> 아가로 오스, 낮은 겔링 온도 </td><td> 시그마 </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> 토끼 방지 콜라겐 I (RB PAB) 항체 </td><td> Abcam </td><td> ab34710 - 100 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 546 염소 안티 - 토끼 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> 토끼 안티 - Laminin </td><td> 시그마 </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy

매트릭스 강성 강력 1-3 자기편 세포의 성장, 분화 및 기능에 영향을 미칩니다. 매크로 스케일에서 인체 내에서 조직과 장기의 강성이 크기 4 몇 가지 명령을 스팬. 훨씬 적게는 강성이 조직 내에 공간 다릅니다 방법에 대해 알려진, 그리고 범위와 강성의 변화 공간적 규모는 조직 리모델링에 발생하는 질병 과정에서 무엇입니까합니다. 매트릭스 강성의 변화는 건강과 질병에서 세포 생리학에 기여하는 방법을 더 잘 이해하기 위해서, 주민등록 세포와 관련된 공간적 규모 얻은 조직 강성의 측정이 필요합니다. 이것은 폐, 매트릭스 개조 이러한 천식, 폐기종, 고혈압 및 섬유증과 같은 질병의 눈에 잘 띄는 기능이있는 매우 준수하고 탄력있는 조직에 특히 사실이다. 상주 세포와 관련된 공간적 규모 폐 실질 조직의 로컬 기계 환경을 특징하기 위해, 우리는 바로 원자 힘 현미경 (AFM) microindentation를 사용하여 신선한 murine 폐 조직의 로컬 탄성 특성을 측정하는 방법을 개발했습니다. AFM 압자, 캔틸레버와 압입 깊이의 적절한 선택과 함께,이 방법은 위상 대조 및 관심 지역의 형광 이미징과 병행하여 지방 조직 전단 계수의 측정을 수 있습니다. 조직 스트립의 체계적인 샘플링 전단 계수 지역 공간적 변화를 밝히지 조직 기계적 성질의지도를 제공합니다. 기계적 특성 및 기본 해부 및 병리 학적 기능 사이의 상관 관계는 강성이 섬유증의 매트릭스 증착에 따라 다릅니다 방법을 보여줍니다. 이 방법은 지방 조직이 기계적 성질은 공간과 질병의 진행에 걸쳐 다양 방법을 나타내기 위해 다른 부드러운 조직과 질병 프로세스를 확장할 수 있습니다.

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Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

세포외 기질의 강성은 강하게 점착 성의 세포의 여러 행동에 영향을 미칩니다. 매트릭스 강성은​​ 조직 전반에 걸쳐 공간 다양하고, 다양한 질병 상태에서 수정을 겪습. 여기 원자 힘 현미경 microindentation를 사용하여 정상 및 fibrotic 마우스 폐 조직의 경직의 공간적 변화를 특징하는 방법을 개발할 수 있습니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

micro-mechanical-characterization-lung-tissue-using-atomic-force

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K 조회수.  Harvard School of Public Health. 세포외 기질의 강성은 강하게 점착 성의 세포의 여러 행동에 영향을 미칩니다. 매트릭스 강성은​​ 조직 전반에 걸쳐 공간 다양하고, 다양한 질병 상태에서 수정을 겪습. 여기 원자 힘 현미경 microindentation를 사용하여 정상 및 fibrotic 마우스 폐 조직의 경직의 공간적 변화를 특징하는 방법을 개발할 수 있습니다.

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Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

연구

생물학

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

3&#39;UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

바렛 식도 세포의 특성에 대한 면역 방법

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

인 - 더 - 필드 응용 프로그램에 대한 설계 및 앱 타머 - 금 나노 입자 기반 비색 분석법 개발

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 접촉 부위의 입체 특성화

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

요약

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