일차 지방전구세포는 지방세포 대사를 조절하는 분자 경로를 이해하는 데 유용한 실험 시스템이다. 닭 배아는 지방세포 발달의 초기 단계에서 지방세포를 분리할 수 있는 기회를 제공한다. 이 방법은 높은 생존력과 성숙한 지방세포로 분화 할 수있는 능력을 가진 세포를 산출하도록 최적화되었으며, 이는 병아리의 초기 생활 지방 성장 및 발달 배아의 기능적 분석에 사용될 수 있습니다.
아디포제닉 분화 과정은 닭과 인간 사이에서 매우 비슷합니다. 따라서, 단리된 지방전구세포는 인간 및 가금류와 관련된 연구를 위한 이중 제안 모델로서 사용될 수 있다. 배아 몸을 70 % 에탄올로 면봉하기 시작하십시오.
그런 다음 소화 후 이후 단계에서 여과 중 간섭을 방지하기 위해 멸균 거즈로 피부 표면을 부드럽게 문질러 깃털을 제거했습니다. 그런 다음 다리와 복부 사이의 피부를 잘라 대퇴골 지방 창고 쌍을 드러냅니다. 한 손으로 구부러진 포셉을 사용하여 다리 주위의 피부를 잡고 대퇴골 피하 지방을 부드럽게 제거하십시오.
다른 한편으로는. 나중에 구부러진 포셉을 사용하여 디포를 다리에서 부드럽게 당깁니다. 조직을 5 밀리리터의 수집 매체가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮기고 지방 패드의 다른쪽에 대해 해부를 반복하십시오.
이제 수집 된 지방 패드를 살균 용액이 들어있는 60 밀리미터 페트리 접시에 옮기고 접시를 몇 번 소용돌이 치면서 간단히 헹구십시오. 그런 다음 지방 패드를 PBS가 들어있는 60 밀리미터 페트리 접시로 옮겨 멸균 용액을 헹구십시오. 플레이트를 부드럽게 소용돌이 치며 다시 PBS로 씻으십시오.
지방 조직의 소화를 위해, 미리 따뜻한 효소 용액을 함유 한 15 밀리미터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브에 한 쌍의 긴 직선 가위를 담그고 마지막으로 용액의 지방 조직을 가능한 한 작은 조각으로 다듬습니다. 다진 조직과 효소 용액을 25 밀리리터 오토클레이브 플라스크에 옮깁니다.
플라스크를 파라핀 필름으로 감싸고 플라스크를 소화를 위해 섭씨 37도의 궤도 쉐이커 인큐베이터에 놓습니다. 소화 후, 부드럽게 위아래로 피펫을 부드럽게 섞어 잘 섞는다. 그런 다음 250 마이크로 미터 조직 스트레이너를 통해 피펫팅하여 15 밀리리터 튜브로 여과하여 소화되지 않은 조직과 파편을 제거하십시오.
이제 플라스크를 네 밀리리터의 성장 배지로 헹구어 플라스크에 부착된 세포를 제거하고 세포 현탁액을 동일한 15밀리리터 튜브로 여과합니다. 다음으로 성장 배지를 다시 피펫팅하여 스트레이너를 헹구어 필터에 갇힌 세포를 제거하십시오. 실온에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리하여 세포 분획을 펠릿화하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡인한다.
펠렛을 한 밀리리터의 적혈구 용해 완충액에 부드럽게 재현탁시키고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 세포를 포함하는 튜브에 다섯 밀리리터의 성장 배지를 첨가하여 세포를 희석하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하십시오. 이제 세포를 40 마이크로 미터 셀 스트레이너 위에 피펫하고 새로운 50 밀리리터 튜브로 여과하십시오.
그런 다음 추가로 다섯 밀리리터의 성장 배지로 스트레이너를 헹구고 실온에서 7분 동안 300배 G에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 조심스럽게 상청액을 흡인하십시오. 나머지 세포 펠릿을 피펫팅에 의해 1 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시켜 세포 밀도 및 생존력을 결정하기 위해, 피펫팅에 의해 트리판 블루에 각 샘플의 10 마이크로리터를 혼합한다.
혼합물 10 마이크로리터를 혈구측정기에 로딩하고 세포를 계수한다. 24, 48, 및 72시간 후의 지방전구세포의 분석은 정상 세포 형태 및 수를 나타내었다. 지방전구세포의 아디포겐 유도는 지질 방울의 빠른 분화 및 축적을 보였다.
분리 동안 지방전구세포의 공격적인 취급은 세포 손상과 낮은 세포 수를 초래했다. 미생물 오염은 예방 조치를 취함에도 불구하고 관찰 될 수 있습니다. 오일 레드 O를 사용한 지질 염색은 지방전구세포가 24, 48, 및 72시간에서 관찰된 바와 같이 시간에 따라 아디포겐 유도하에 지질 방울을 빠르게 발달시키기 시작하고 축적이 진행됨을 나타내었다.
세포 수에 대한 지질 축적을 지질 및 DNA 염색을 사용하여 정량화하였다. 지질 축적과 세포 증식 둘 다 시간이 지남에 따라 증가하였다. 낮은 세포 수 또는 손상된 세포는 조직 분획이 너무 오래 소화될 때 관찰될 수 있다.
따라서 소화 시간이 한 시간 반 이상 지속되지 않는 것이 좋습니다. 단리된 지방전구세포는 유전자 발현 연구에 사용될 수 있다. cDNA 합성 및 후속 qPCR 또는 RNAseq에 사용하기 위해 충분한 RNA를 수득할 수 있다.
