이 방법은 유전 다양성 패널 또는 번식 집단 내에서 이용 가능한 비 광화학적 담금질의 유전 적 변이에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 하루 내에 비 광화학적 담금질의 변화에 대해 많은 수의 유전자형을 스크리닝 할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 글리신 맥스 또는 콩에 대해 제시되지만 리프트 디스크를 수집 할 수있는 다른 식물 공간을 분석하도록 조정할 수 있습니다.
처음으로 프로토콜을 수행하는 사람의 경우, 열쇠는 물로 인한 손상이나 과포화 스폰지를 방지하기 위해 리프트 디스크를 처리하는 것입니다. 시작하려면 발아 후 30 일 후에 현장 사이트에서 식물을 샘플링하십시오. 24웰 플레이트의 모든 웰에 1/3 레벨의 증류수를 채웁니다.
뚜껑과 플레이트의 측면에 샘플링할 반복실험으로 라벨을 붙입니다. 식물 꼭대기에있는 가장 어린 완전히 확장 된 잎을 고무 마개에 대고 잡으십시오. 두 번 훔볼트 코르크 보어를 잎을 통해 누르고 비틀어 디스크를 자르고 중간 갈비뼈를 피하십시오.
기술 반복실험을 위해 동일한 리프에서 다섯 개의 디스크를 연속적으로 수집합니다. 코크 보어에서 잎 디스크를 면봉을 사용하여 24 웰 플레이트의 단일 웰로 밀어 넣고 동일한 유전자형의 다른 식물에 대해이를 반복하십시오. 모든 리프 디스크가 물에 떠 있는지 확인하십시오.
그렇지 않은 경우 우물 측면에 달라 붙은 잎 디스크를 면봉으로 떠있는 위치로 부드럽게 옮깁니다. 다음 그림에서 샘플링 디스크로 이동합니다. 뚜껑을 놓고 반투명 플렉시블 필름으로 밀봉하십시오.
전체 24-웰 플레이트에서 샘플링을 완료한 후. 접시를 직사광선으로부터 가방, 상자 또는 빈 냉각기에 보관하십시오. 깨끗한 실험실 공간에서 밀봉 된 플레이트의 뚜껑을 탭하여 운송 중에 뚜껑에 붙어있는 잎 디스크를 제거하십시오.
필름 포장을 풀고 뚜껑을 분리합니다. 잎 디스크를 24웰 플레이트의 첫 번째 위치에서 잎 디스크가 웰 바닥에서 평평하게 아래로 향하게 하여 신선한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 비강 흡입기 필터를 반으로 자릅니다.
생성 된 필터를 물에 반쯤 담그고 종이 타월에 담그면 과도한 액체를 제거하십시오. 습도를 유지하기 위해 리프 디스크가있는 우물에 필터를 삽입하십시오. 24웰 플레이트의 첫 번째 위치에서 두 번째 리프 디스크를 가져와 96웰 플레이트의 다음 사용 가능한 위치에 아래로 향하게 놓습니다.
생성 된 비강 필터의 나머지 절반을 물에 담그고 종이 타월에 담그고 두 번째 잎 디스크로 우물에 삽입하십시오. 오른쪽 위 모서리에 테이프를 붙여서 어두운 곳에서 플레이트를 배치하여 이미징을 할 수 있도록 합니다. 플레이트를 반투명 플렉시블 필름으로 밀봉하고 플레이트를 알루미늄 호일로 감쌉니다.
플롯 ID와 플레이트 ID를 알루미늄 호일에 씁니다. 비광화학적 담금질의 처음 두 단계의 이완을 위해 최소 30분 동안 어두운 상자 또는 캐비닛에 플레이트를 놓으십시오. 비광화학적 담금질의 장기 단계가 관심이있는 경우 이미징 전에 한 시간의 장기간의 어두운 잠복기를 사용하십시오.
신선한 96웰 플레이트의 각 모서리에 잎 디스크를 배치하고 중앙에 하나씩 배치하여 분석 중에 초점을 맞추기 위한 추가 더미 플레이트를 준비합니다. 이전 플레이트와 마찬가지로 비강 필터로 잎 디스크를 고정하고 플레이트를 밀봉하며 실온 및 50 % 상대 습도에서 어둠 속에서 배양하십시오. 이미저를 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다.
설정 다음에 프로토콜을 클릭하여 PAM 실험 프로토콜의 단계 입력 창을 엽니다. 원고에 제공된 기계의 기술 사양을 설정하십시오. 포화 펄스로 시작하도록 프로그램을 설정하여 지연 후 (After a Delay)라는 상자에 20 초를 입력하여 어두운 적응 광합성의 최대 양자 효율을 측정하십시오.
펄스 적용 상자를 클릭하고 이 횟수라는 제목의 상자에 1을 입력합니다. 펄스 PPFD를 6, 152로, 펄스 길이를 800밀리초로 설정하고, 모든 펄스가 있는 F 프라임 및 FM 프라임 이미지 가져오기 상자를 선택합니다. 다음 삽입을 선택하여 프로토콜에 두 번째 단계를 추가합니다.
지연 후 제목의 상자에 30초를 입력합니다. 그런 다음 악티닉 변경 옵션을 선택하고 Actinic PPFD라는 상자에 50을 입력하여 챔버의 광도를 50PPFD로 설정합니다. 다음에 삽입을 클릭하여 프로토콜에 새 단계를 추가하고 지연 후 라는 제목의 상자에 150초를 입력합니다.
펄스 적용을 선택하고 이 횟수라는 제목의 상자에 4번을 입력하여 악티닉 라이트가 50PPFD로 유지되는 동안 150초마다 측정 펄스를 연속으로 네 번 적용합니다. 프로토콜을 원하는 위치에 pcl 파일로 저장하기 전에 원고에 제공된 값에 따라 각 단계의 지연 및 광 강도를 조정하십시오. 빛을 끄고 더미 플레이트를 샘플 스테이지에서 아래로 향하게 하여 잎의 부축 표면이 검출기를 향해 위쪽을 가리키고 스폰지가 플랫폼 쪽으로 향하도록 합니다.
리프 디스크가 장비 바닥보다 140mm 위에 오도록 샘플 스테이지 높이를 설정합니다. 이미저 카메라 및 하드웨어 카메라에 연결/연결 끊기 아이콘을 클릭하여 카메라를 시작합니다. 베이스에 두 개의 녹색 선이 있는 빨간색 색상의 양면 화살표 아이콘으로 표시되는 초점 형광 기호를 클릭하고 렌즈와 노출을 조정하여 플레이트에 초점을 맞춥니다.
초점 형광 아이콘을 다시 클릭하여 깜박이는 빛을 끕니다. 어둠 속에서 일하면서 더미 플레이트를 분석 할 플레이트로 교체하십시오. 오른쪽 상단 모서리의 방향을 지정하는 데 사용되는 바깥쪽에 테이프를 놓고 지도 이미지 카메라 아이콘을 클릭합니다.
팝업 창의 막대가 녹색 영역에 위치할 때까지 조리개를 열거나 닫아 이미지 노출을 조정합니다. 조리개를 조정할 때마다 노출이 올바르게 조정되고 계측기가 이미지를 촬영할 때까지 다시 시도 단추를 클릭합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이미지 격리 적용을 선택하여 배경 신호를 차단합니다.
초점이 맞춰진 리프 영역은 회색으로, 배경은 파란색으로 표시됩니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 이미지 수정 풀다운 메뉴에서 히스토그램 및 감마 레벨을 조정하여 리프 디스크만 포함시키려는 영역 또는 픽셀을 선택합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 높고 낮은 컷 삭제를 선택하여 연한 파란색으로 강조 표시된 영역을 삭제합니다.
이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 스트레이 삭제를 선택하여 마지막 세 개의 다른 픽셀을 건드리지 않는 픽셀을 제거합니다. 격리된 섬으로 표시되는 이미지의 모든 영역은 별도로 분석되어 최종 데이터 출력에 포함됩니다. 프로토콜 실행 아이콘 을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.
화면 하단에 타이머가 나타나 프로토콜이 실행되기까지 얼마나 오래 남았는지 알려줍니다. 프로토콜이 완료 될 때까지 기다리십시오. 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭하여 데이터를 igr 파일로 저장합니다.
다른 샘플 플레이트를 시작하기 전에 창의 오른쪽 상단에 있는 빨간색 십자선을 클릭하여 창을 닫습니다. 엽록소 형광 데이터를 내보내려면 이미징 소프트웨어에서 igr 파일을 열고 파일을 클릭 한 다음 폴더로 내보내기를 클릭하여 필요한 모든 파일이있는 새 폴더를 만듭니다. 현장에서 재배 된 콩에서 비 광화학 담금질의 전형적인 측정은 잎 디스크가 초당 미터 당 50 마이크로 몰의 낮은 빛에 노출 될 때 Fv / Fm을 결정하기 위해 초기 포화 플래시 후에 비 광화학 담금질이 하나 미만이라는 것을 보여주었습니다.
또한, 초당 미터당 2, 000 마이크로몰의 높은 광으로 전달시, 비-광화학적 담금질은 15분 후에 최대 네 개까지 증가하였다. 실패한 측정은 높은 빛으로 전달 될 때 비 광화학 담금질의 최소 증가를 보였다. 이미저 내의 플레이트 방향을 정하고 리프 디스크를 샘플링하고 도금하기 위해 명확하게 정의 된 계획은 데이터가 올바른 유전자형에 연결되도록하는 데 필수적입니다.
이 프로토콜은 가뭄 및 흘림과 같은 환경 변수가 비 광화학 담금질에 미치는 영향을 정량화하거나 작물 모델을 정제하기 위해 다른 캐노피 수준에서 비 광화학 담금질을 평가할 수 있습니다.
