이 프로토콜은 대사 산물 및 기생충 분포의 3D 모델을 구축하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 국소 조직 대사 교란, 기생충 분포 및 임상 질환 증상 사이의 관계를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 대사 산물 분포 대 병원체 분포 및 통계 분석의 라이브 스케일 교차 장기 매핑을 가능하게한다는 것입니다.
이론적으로 화학 지도 제작은 병인과 치료 효과를 담당하는 대사 산물을 직접 검사하여 숙주에 대한 질병의 발달과 영향을 탐구 할 수 있습니다. 튜브를 칭량하고 라벨을 붙이는 것으로 시작하십시오. 조직을 튜브 당 하나의 섹션으로 체계적으로 단면화하십시오.
조직 샘플이 들어있는 튜브의 무게를 측정하여 샘플 무게를 결정하고 무게를 기록하십시오. 조직 샘플의 수성 균질화를 수행하려면 조직 샘플을 포함하는 두 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 하나의 다섯 밀리미터 스테인레스 스틸 비드를 추가하십시오. LCMS 등급의 물이 들어있는 빈 튜브 하나를 만드십시오.
냉각된 LCMS 등급 물을 첨가하여 시료 50밀리그램당 500마이크로리터의 부피를 구성한 다음, 샘플을 25헤르츠에서 3분 동안 균질화합니다. 샘플은 철저히 균질화되어야합니다. DNA 추출 및 기타 분석을 위해 균질화 부피의 1/10을 수집합니다.
네 마이크로몰의 설파클로로피리다진으로 스파이크된 얼음 차가운 LCMS 등급 메탄올을 균질액에 첨가한다. 샘플을 조직 균질기에서 3분 동안 25 헤르츠에서 균질화하고, 이어서 10분 동안 원심분리한다. 같은 부피의 상청액을 96 웰 플레이트에 모으고 상청액을 수집하는 동안 얼음 위에 단단한 잔류 물을 보관하십시오.
수성 추출 상청액을 최대 속도와 가열 없이 사용하여 완전히 건조시킨다. 고체 잔류 물 샘플 50 밀리그램 당 두 개의 마이크로몰 설파클로로피리다진으로 스파이크된 미리 냉각된 디클로로메탄 메탄올 1,000 마이크로리터를 첨가하여 유기 추출을 수행한다. 샘플을 5분 동안 25헤르츠에서 균질화하고, 10분 동안 원심분리하였다.
같은 양의 상청액을 96 웰 플레이트에 넣으십시오. 관심있는 기관의 사진을 찍으십시오. 파일을 클릭 한 다음 SketchUp 소프트웨어에서 가져 오기를 클릭하여 관심있는 기관의 그림을 가져옵니다.
선 도구를 클릭하고 자유형 옵션을 선택하십시오. 연필 도구를 사용하여 관심있는 기관의 윤곽선을 추적하고 그립니다. 밀어넣기/당기기 도구를 선택하고 음영처리된 영역을 위로 당겨 드로잉을 2D에서 3D로 변환합니다.
파일 내보내기를 클릭한 다음 3D 모델을 클릭하여 dae 형식으로 파일을 내보냅니다. 모델의 사실성을 향상시키려면 파일을 선택한 다음 메쉬 가져오기를 클릭하여 모델을 MeshLab 소프트웨어로 가져옵니다. 상단 메뉴에서 와이어프레임을 선택한 다음, 필터를 선택하고 리메시 단순화 및 재구성을 클릭한 다음, 세분할 서피스 중간점을 클릭합니다.
모든 값을 기본값으로 두고 적용을 두 번 선택합니다. 파일을 클릭한 다음 메쉬를 다른 이름으로 내보내기를 클릭한 다음 형식 드롭다운 메뉴의 파일에서 SDL 파일 형식을 선택하여 모델을 sdl 형식으로 내보냅니다. 이것을 저장하고 다음 팝업 메뉴에서 확인을 선택하십시오.
Meshmixer 소프트웨어를 열고 이전 단계에서 생성된 sdl 파일을 가져옵니다. 조각, 브러시, 드래곤 조각, 브러시, 팽창 도구를 사용하여 반올림해야하는 모델 표면을 꺼냅니다. 모델이 원하는 모양을 갖게되면 파일 및 내보내기를 클릭하여 sdl 형식으로 저장하십시오.
원하는 대로 파일 이름을 지정하고 SDL 바이너리 형식을 선택한 후 저장합니다. MeshLab 소프트웨어에서 3D 모델을 엽니다. 포스트 오픈 처리 팝업 창에서 확인을 클릭하십시오.
선택점 도구를 선택하여 각 샘플링 스폿에 대한 X, Y 및 Z 좌표를 가져온 다음 3D 모델 서피스에서 정기적으로 간격을 두고 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 원하는 좌표가 모두 선택되면 양식 팝업 창에서 맨 위에 있는 저장 단추를 클릭합니다. 스프레드 시트 소프트웨어에서 이전 단계에서 생성 된 pp 파일을 엽니 다.
데이터 텍스트를 열로 클릭한 다음 구분을 클릭하여 데이터 표시를 조정합니다. 다음을 클릭 한 다음 공간을 선택하고 마침을 클릭하십시오. 홈 찾기 및 바꾸기 선택을 선택하여 스프레드시트 셀에 숫자 값만 남도록 서식을 다시 지정합니다.
찾을 상자에 Y 등수 코트를 입력하고 바꾸기 상자를 비워 둡니다. 모두 바꾸기를 클릭 한 다음 확인을 클릭하십시오. X 동일한 코트와 Z 동일한 코트 및 보다 큰 코트 슬래시에 대해 반복하십시오. 스프레드시트 소프트웨어 테이블에서 행은 각 위치에 해당하고 열은 데이터에 해당합니다.
적절한 메타데이터와 풍부한 대사산물 특징을 후속 스프레드시트 열에 붙여 넣습니다. 반지름 열에 모델에서 시각화할 샘플링 스폿의 원하는 크기를 입력합니다. 반경의 값을 경험적으로 결정하고 파일을 CSV 형식으로 저장합니다.
ELI 플롯 소프트웨어로 이동하여 서피스(Surface)를 선택한 다음, 생성된 3D 모델을 브라우저 창으로 끌어다 놓습니다. 생성된 피쳐 테이블을 동일한 브라우저 창으로 끌어다 놓습니다. 오른쪽 아래 모서리에 있는 범례를 사용하여 3D 모델에 원하는 데이터 열을 투영합니다.
각 데이터 열을 연속적으로 선택하여 3D 모델에서 이 대사산물 피쳐의 분포를 평가합니다. 이 분석을 통해 5, 502 개의 피처와 3D로 시각화 된 테이블이 탄생했습니다. 이 접근법은 높은 기생충 부하의 부위에서 높은 개별 동물의 대사 산물 특징, 조직 영역에 걸쳐 차별적 인 분포를 가진 대사 산물 및 소장과 대장에서 비슷한 수준에서 발견되는 대사 산물 특징을 시각화 할 수있게합니다.
LCMS 용매 만 사용하고 모든 인접한 조직을 수집하고 공간지도의 틈새를 피하기 위해 수집 된 모든 샘플에 대한 대사 산물을 추출하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 Trypanosomatid 기생충에 의한 조직 식민지화에 대한 영양 요구 사항을 탐구하여 감염시 3D 대사 산물 분포도를 비교하여 질병 병인을 이해하는 데 사용할 수 있습니다.
