우리는 샤페론 코카페론 상호 작용을 연구하기 위해 균일 한 비드 기반의 분석기를 구축했습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 Hsp90과 FKDP51 또는 FKBP52 사이 상호 작용을 억제하는 작은 분자를 검열하고 강력하고 선택적인 억제제를 확인합니다. 이 높은 처리량 스크리닝 기술은 견고하고 신뢰할 수 있습니다.
결과는 1 시간 안에 얻을 수 있고, 단지 구슬 단백질 및 화합물의 소량을 요구합니다. 이 코카페론과의 Hsp90 상호 작용은 알츠하이머 병, 암, 자가 면역 질환과 같은 인간 질환에 연루되었습니다. 이 기술은 높은 의학적 중요성을 가진 보호자 코차페론 억제제를 선별할 수 있는 기회를 제공합니다.
다음은 이 분석의 기본 원칙입니다. hsp90C-말단 펩타이드와 코카페론의 TPR 도메인 간의 상호 작용이 기증자와 수용자 구슬을 근접하게 만들면 고도로 증폭된 신호가 생성됩니다. 상호 작용 억제제가 추가되면 기증자 및 수용자 구슬이 근접에 도달할 수 없으며 감지 가능한 신호가 생성되지 않습니다.
PBS의 Hsp90 펩티드를 밀리리터 농도당 1밀리그램으로 희석하여 시작합니다. PBS에서 비응유수령구 구슬을 희석하고 구슬을 1.5 밀리리터 튜브로 옮킨다. 희석된 구슬을 원심분리한 다음 상체를 조심스럽게 제거합니다.
컨쥬게이팅의 경우, 펩티드에 수용인 비드를 10 대 1의 비율로 설정한다. PBS 희석 펩타이드, Tween 20 및 시아나보로 하이드라이드 용액의 팔레타이드 구슬에, 그리고 회전 셰이커에 끝 이상 동요와 함께 배양. 반응하지 않은 부위를 차단하려면 pH 8.0의 어금니 트리스 염산염 용액 1개 중 20마이크로리터를 구슬에 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 반응을 담금질한다.
인큐베이션이 끝나면 구슬을 원심분리로 씻고 트리스 염산염 용액의 1밀리리터에서 비드 펠릿을 다시 중단한다. 세탁을 두 번 더 반복합니다. 마지막 세척 후, 저장 버퍼에 밀리리터 농도 당 1 밀리그램으로 구슬을 다시 중단하고 빛으로부터 보호되는 4섭씨에 컨쥬게이드 수용자 비드 용액을 저장합니다.
PBS에서 밀리리터 농도당 10 마이크로그램의 글루타티온 기증자 구슬을 추가합니다. GSTFKBP51을 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도에 추가하고 어둠 속에서 섭씨 25도에서 10분 동안 반응을 배양합니다. DMSO에서 테스트 화합물의 직렬 희석을 합니다.
시험 화합물 희석제의 0.25 마이크로 리터를 추가하고 384 웰 플레이트의 각 웰의 모서리에 삼중 고리를 추가합니다. 음수 제어를 위해, DMSO의 0.25 마이크로리터를 추가하고 양수 제어를 위해, 우물에 Hsp90 C-말단 펩타이드의 0.25 마이크로리터를 추가합니다. GST 태그 단백질을 가진 글루타티온 기증자 구슬을 포함하는 용액의 22.5 마이크로리터를 각 우물에 추가합니다.
손으로 접시를 완전히 흔들고 15 분 동안 섭씨 25도에서 어둠 속에서 배양하십시오. 부착된 Hsp90C-말단 펩타이드로 수용조 비드를 밀리리터 농도당 100 마이크로그램으로 0.5배 PBS로 희석한다. 각 웰에 희석 된 수용자 구슬 2.25 마이크로 리터를 추가합니다.
어둠 속에서 접시를 흔들어 15분 동안 배양합니다. 플레이트 판독기 계측기를 켜고, 플레이트의 신호를 측정하고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 데이터를 분석한다. 환영 대화 상자에 X-Y 데이터 테이블을 만들고 X 번호, Y를 선택하고 나란히 열에 세 개의 복제 값을 입력합니다.
농도 값을 X 열로 가져오고 신호 값을 Y 열로 가져옵니다. 분석을 클릭하고, 농도 X 변환을 선택한 다음, 로개반스로 변환을 선택합니다. X-Y 분석에서 비선형 회귀를 분석하고 선택합니다.
용량 응답 억제 옵션을 열고 응답 변수 경사 방정식대 로그를 선택합니다. IC50 값과 그래프가 포함된 결과를 보려면 확인을 클릭합니다. 이 분석은 작은 분자를 선별하기 위해 사용되었으며 Hsp90과 FKBP51 또는 FKBP52 사이의 상호 작용을 억제했습니다.
0.8 이상의 Z 점수와 13.35의 배경 비율에 대한 신호는 높은 처리량 스크리닝을 위한 견고성과 신뢰성을 보여줍니다. 작은 분자량 테스트 화합물 D10의 효과가 샤페론-코카페론 상호작용의 억제에 대한 평가및 IC50 값을 계산하였고, 여기서 D10은 용량 의존억제를 보였다. Hsp90 GSTFKBP51 상호 작용에 대한 IC50 값은 65 나노 몰러였습니다.
Hsp90의 경우, GSTFKBP52 상호 작용의 경우, 완전한 억제는 가장 높은 화합물 농도로 달성되지 않았기 때문에 작은 분자와의 단백질 단백질 상호 작용의 선택적 억제를 달성할 수 있음을 나타냅니다. 중요한 단계는 추가 순서입니다. 우리는 먼저 작은 분자와 TPR 표적 사이 복합체를 형성합니다.
그렇지 않으면 더 긴 잠복및 더 높은 화합물 농도가 필요합니다. 우리는 Hsp90과 FKB51 또는 Hsp90 및 FKB52 사이 상호 작용을 방해하는 작은 분자를 위해 이 기술을 이용할 수 있습니다. 또한 Hsp90, Hsp70 및 코차페론 선별억제제를 함유한 TPR 모티프 간의 상호작용으로 확장할 수 있다.
