이 방법은 세포 배양 실험을 위해 장착 된 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 신장 발달 및 질병 경로에 대한 이해를 증진시킬 수 있습니다. 이것은 신장 오가노이드를 생성하는 다른 사람들에 비해 상대적으로 간단하고 저렴한 방법입니다.
이 기술의 가장 큰 과제는 고품질의 인간 다능성 줄기 세포 배양을 유지하는 것입니다. 세포가 80 % 미만으로 유지되고 정기적으로 분할되는 것이 중요합니다. 인간 다능성 줄기 세포 배양을 처음 접하는 연구자들은 분화를 진행하기 전에 줄기 세포주에 익숙해 져야합니다.
여섯 웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 완전한 E5-ILP 배지 두 밀리리터를 첨가하여 신장 오가노이드 분석을 시작하십시오. 인간 만능 줄기 세포 또는 hPSC를 60 % 합류율에 도달 할 때까지 100 밀리미터 조직 배양 처리 플레이트에서 배양하십시오. hPSC를 약 여덟 밀리리터의 DPBS로 두 번 씻으십시오.
DPBS를 흡인한 다음, 세포를 덮기 위해 디스파제 두 밀리리터를 적가하고, 섭씨 37도에서 6분 동안 배양한다. 약 10 밀리리터의 DPBS로 세포를 세 번 씻으십시오. DPBS를 흡인한 다음 플레이트를 45도 기울인 다음 셀 리프터로 세포를 긁어냅니다.
콜로니를 10 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 6 밀리리터의 완전한 E5-ILP 배지로 위에서 씻어 내십시오. 그런 다음, 피펫을 수직으로 잡고, 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 큰 콜로니를 분해하고, 배양 플레이트의 측면에 닿지 않도록 주의한다. 웰 당 한 밀리리터를 여섯 웰 플레이트에 추가하여 콜로니 클러스터를 고르게 분배 한 다음 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터 내부의 궤도 쉐이커에 놓습니다.
대안적으로, 오비탈 진탕기가 이용가능하지 않으면, 세포는 정적으로 배양될 수 있다. 둘째 날, 배아체가 플레이트의 바닥에 정착하게 한 후, 플레이트를 45도 기울인 다음 배지를 위에서 천천히 흡인하여 웰 당 한 밀리리터를 남깁니다. 웰 당 두 밀리리터의 준비된 완전한 배지를 넣고 플레이트를 다시 쉐이커로 되돌립니다.
셋째 날에, 이전에 입증된 바와 같이 배지를 흡인한 후, 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 각 웰로부터 모든 배아체를 조심스럽게 수집하고, 이를 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮긴다. 남아있는 배아체를 수집하려면 각 웰을 저포도당 DMEM 한 밀리리터로 헹구고 동일한 50밀리리터 원뿔형 튜브에 첨가하십시오. 배아체가 튜브 바닥에 정착하기를 기다리는 동안 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 두 밀리리터의 Stage II 배지를 추가하십시오.
다음으로, 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브 위에 200마이크로미터 세포 스트레이너를 놓고 모든 배아체를 세포 스트레이너 위에 조심스럽게 피펫팅하여 큰 배아체를 체질한다. 세포 스트레이너를 추가로 다섯 밀리리터의 DMEM으로 헹구어 스트레이너에 붙어있는 배아체를 수집합니다. 나중 단계에서는 먼저 500 마이크로 미터 스트레이너를 사용하여 매우 큰 배아체를 체로 만든 다음 여과액을 200 마이크로 미터 스트레이너를 통해 통과시켜 세뇨관이없는 매우 작은 배아체를 체질합니다.
200 마이크로 미터 스트레이너를 새로운 50 밀리리터 튜브로 반전시키고 DPBS로 스트레이너를 세척하여 200 ~ 500 마이크로 미터 사이의 올바른 크기의 배아체를 수집하십시오. 긴장 후, 배아체가 원뿔형 튜브의 바닥에 정착 한 다음 상청액을 흡인하고 약 10 밀리리터의 DMEM으로 씻으십시오. 그런 다음, 배아체를 여섯 밀리리터의 단계 II 배지에 재현탁시킨다.
배아체를 다시 여섯 웰 초저 부착판으로 옮겨 우물 사이에 고르게 분배한다. 대부분의 오가노이드가 피펫 상단에 모이기 때문에 끝에 약 반 밀리리터를 남겨 둔 다음 각 웰의 미디어에 팁을 부드럽게 만져서 오가노이드가 우물로 흘러 들어갈 수 있습니다. 배아체를 45밀리리터의 Stage II 배지가 있는 125밀리리터 스피너 플라스크에 옮깁니다.
자기 교반 속도를 120 rpm으로 설정하고 플라스크를 인큐베이터에 넣습니다. 배아체 또는 신장 오가노이드를 먹이려면 스피너 플라스크의 바닥에 잠깐 정착시킨 다음 플라스크의 한쪽 팔에서 뚜껑을 들어 올리고 팁이 반대쪽 내부 벽에 닿아 흡기 피펫을 안쪽에 놓습니다. 피펫을 천천히 아래로 기울이고 배지의 약 절반을 흡인합니다.
20 밀리리터의 신선한 Stage II 배지로 동일한 개구부를 통해 피펫팅하여 보충하십시오. 긴 멸균 포셉을 사용하여 배아체 또는 신장 오가노이드가 있는 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 자석 교반 막대 하나를 조심스럽게 배치합니다. 플레이트를 육륜 마그네틱 교반 플레이트 상에 놓고, 속도를 120 rpm으로 설정하였다.
자기 교반 막대가 제자리에 끼워져 회전을 시작하려면 먼저 전력 레벨을 100으로 설정하십시오. 모든 막대가 회전하기 시작하면 전력 레벨을 25로 낮춥니다. 이전에 입증 된 바와 같이 배지의 절반을 변경하여 신장 오가노이드를 유지하십시오.
제14일째 신장 오가노이드의 파라핀 절편의 면역형광은 간세포 핵 인자-1 베타 및 로터스 테트라고놀로버스 렉틴을 발현하는 신장 세뇨관과 같은 네프론 세그먼트뿐만 아니라 V-maf 근아포신경성 섬유육종 종양유전자 상동체 B 및 네프린을 발현하는 podocyte 클러스터의 존재를 보여준다. 이 프로토콜의 변형은 배양 26일째에 혈소판 및 내피 세포 부착 분자-1로 염색함으로써 확인되는 바와 같이 내피 세포의 확장을 지원할 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포는 적절한 시간 동안 Dispase로 처리 한 다음 모든 흔적을 제거하기 위해 철저히 씻어야합니다.
Dispase가 완전히 제거되지 않으면 세포 사멸 및 배아체 군집화로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 선천성 신장 질환뿐만 아니라 다양한 신장 손상 경로 및 체외 치료 개입 가능성을 검사하는 데 도움이되었습니다.
