이 프로토콜의 전반적인 목표는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 비용 효율적일 뿐만 아니라 생체 내 환경에서 병난 근육의 재생 가능성을 채점할 때 매우 재현가능한 고처리량 파이프라인을 제공합니다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 아브니카 루파렐리아, 호주 재생 의학 연구소의 연구 원이 될 것입니다.
살아있는 배아 지오노티핑의 경우, 24 챔버 DNA 추출 칩의 상단 표면에서 명확한 보호 필름을 껍질을 벗기고 칩의 각 챔버로 배아 배지의 13 마이크로 리터에서 단일 마취 배아를 전송하는 절단 팁이있는 20 마이크로 리터 필터 팁을 사용합니다. 모든 배아가 적재되었을 때 칩을 제브라피쉬 배아 지노티핑 플랫폼에 부드럽게 장착한 다음 칩의 나머지 부분을 먼저 배치합니다. DNA 추출 프로토콜 동안 배아 배지의 증발을 방지하고 뚜껑을 닫기 위해 자석 플랫폼 뚜껑을 칩 위에 부착합니다.
기본 유닛을 2.4볼트, 0.051 암페어 및 0.12 와트로 설정하고 DNA 추출 프로토콜을 시작합니다. 플랫폼은 진동을 시작해야 하며, 뚜껑을 부드럽게 터치하여 평가할 수 있습니다. 프로그램이 실행되는 동안, 각 우물에 배아 배지의 1 밀리리터를 추가하여 24 웰 플레이트를 준비하고 각 배아에서 DNA 물질의 수집에 사용되는 8 웰 스트립 튜브를 라벨.
8분간의 추출 후 온/오프 버튼을 눌러 플랫폼의 진동을 멈추고, 자석 뚜껑을 부드럽게 제거하고 플랫폼에서 칩을 들어 올립니다. 배아 배지 10개를 한 챔버에서 8웰 스트립 튜브의 적절한 우물로 옮기고 즉시 2방울의 신선한 배아 배지를 챔버에 첨가한다. 이전에 준비된 24웰 플레이트의 적절한 우물로 챔버에서 배아를 이송한다.
모든 배아가 옮겨지면 플레이트를 섭씨 28도에 놓습니다. 각 배아의 유전자형을 결정하기 위해 8웰 스트립 튜브에서 수집된 유전 물질에 대한 적절한 하류 유전성 검사를 수행한다. 각 배아의 유전자형이 확인되면, 배지수 25밀리리터를 함유한 90mm 페트리 접시로 배아를 옮기고 근육 부상까지 28도에서 플레이트를 배양합니다.
수정 후 4일 동안 파이펫을 사용하여 마취된 애벌레 하나를 새로운 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경으로 접시에서 여분의 배지를 조심스럽게 제거합니다. 머리가 왼쪽에 있고, 꼬리가 오른쪽에 있고, 등쪽 영역이 위이고, 복부 영역이 다운되고, 30 게이지 바늘을 사용하여 항문 모공 위의 에센스 근육과 심근에 수평으로 1~2개의 솜라이트로 빠르게 정밀하게 찌르도록 합니다. 부상당한 제브라피시에 배아 배지 한 방울을 바르고 애벌레를 24웰 플레이트 의 1밀리리터를 잘 배아 매반1밀리리터로 조심스럽게 옮기는다.
모든 애벌레가 다쳤을 때, 제브라피쉬가 이미지될 때까지 접시를 섭씨 28도 인큐베이터에 놓습니다. 근육 재생을 정량화하기 위해, 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램에서 1 일 후 부상 이미지를 열고 다각형 도구를 사용하여 상처 부위 주위에 모양을 그립니다. 소프트웨어를 사용하여 영역의 영역과 평균 배금 강도를 측정하고 이러한 값을 제공된 템플릿의 셀 D3 및 E3에 복사합니다.
각각 1~2개의 부상되지 않은 소미트에 걸쳐 두 개의 추가 지역을 그리고 지역을 측정하고 각 지역의 배금 강도를 의미합니다. 템플릿의 셀 D4 및 D5 및 E4 및 E5셀에 이러한 값을 복사합니다. 그런 다음 부상 후 3일 동안 동일한 영역에 대한 측정값을 반복합니다.
모든 이미지에서 동일한 방식으로 배어를 측정한 경우 각 영역의 평균 비리링스 강도를 해당 영역별로 나누어 각 영역에 대한 정규화된 자작나무를 계산합니다. 각 시간 지점에 대해, 부상되지 않은 두 지역의 평균 정규화된 자경작을 계산하여 부상되지 않은 근육에 대한 기준점을 제공합니다. 부상 후 첫날근육 부상 정도를 결정하기 위해 부상 부위의 정규화된 배금류를 부상 부위의 평균 정상화된 비리로 나눕니다.
근육 재생의 정도를 결정하기 위해, 이 단계에서 부상 부위의 평균 정규화된 강도에 의해 부상 후 3일 동안 부상 부위의 정규화된 배금함을 나눈다. 마지막으로, 부상 후 3일째에 근육 재생 정도에 대한 값을 부상 후 첫날근육 부상 정도에 대한 값으로 나누어 재생지수를 계산한다. 이 대표적인 분석에서, 두 라마2 이종구스 제브라피시 사이의 십자가에서 배아의 클러치는 DNA 추출 칩으로 전송되고 그 후에 유전자형.
근육 부상은 부상 후 첫날에 자작 나무 강도의 감소결과, 근육의 성공적인 재생은 같은 지역 내에서 증가 자작기 결과. 야생형 애벌레가 정상적인 근육 패터닝으로 인해 균일한 배금 강도를 표시하는 반면, 라마2 녹아웃 애벌레의 근육의 배어 강도는 근육 무결성 감소로 인해 고르지 못하고 산발성이 높다는 점도 주목할 만하다. 관찰된 바와 같이, 야생 형과 Lama2 결핍 유충은 1 일 후 부상에 비해 3 일 후 부상 부위에서 크게 증가 된 배금 강도를 보여 주며 근육이 재생되었음을 나타냅니다.
재생 지수의 결정은 Lama2 결핍 유충이 야생 형 동물에 비해 근육 재생의 눈에 띄는 증가를 표시한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 우리가 근육 질병의 모형에서 재생하는 근육의 기능에 있는 어떤 변경든지 확인하는 것을 허용할 것입니다, 다운스트림 세포 및 분자 분석은 관찰된 변경에 책임 있는 기계장치를 확인하기 위하여 능력을 능력을, 능력을 발휘할 필요가 있습니다. 이 방법은 우리가 어떻게 손상된 근육 줄기 세포 기능 및 관련된 틈새 요소에 있는 손상이 근육 질병 병인에 기여하는지 확인하는 것을 허용했습니다, 그러므로 우리가 새로운 질병 기계장치를 확인하는 것을 허용했습니다.
