Name: fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide
Uploaded: 2020-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
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저자는 원고의 비판적 검토에 대한 에밀리 호세에게 감사드립니다. 이 작품은 재단 "라 리그 콘트레 르 암", "퐁디아크 부어 라 레체쉬 쉬르 르 암", 그리고 "센터 국립 드 라 레체쉬 사이엔티피크"(CNRS)에 의해 지원되었다.

1. 대형 유니라멜라 소포 준비 (LUV)
<ol><li>형광 누출 분석에 대 한 모방 세포 막으로 그들의 사용에 대 한 LUV를 준비.</li>
	<li>해밀턴 유리 주사기 인스파디딜콜린(DOPC, 786.11 g/mol), 스핑크고미엘린(SM, 760.22 g/mol) 및 콜레스테롤(철, 386.65 g/mol)과 함께 4:4:2의 어금니비와 섞는다. 지질용 액액은 메탄올/클로로폼(3/1; 부피/부피)에서 25mL 유리 원형 플라스크에서 25 mg/mL의 용매로 용해된 각 지질의 스톡 용액으로부터 얻어진다. DOPC의 4μmol, SM의 4 μmol, 2 μmol, 철의 2 μmol를 기준으로, 지질 용액은 각각 126 μL, 117 μL 및 31 μL을 혼합하여 스톡 용액에서 얻어진다. 주의: 메탄올은 독성 및 인화성 용매이며 클로로폼은 독성및 발암성입니다. 둘 다 후드 아래에서 적절한 보호 기능을 처리해야 합니다.</li>
	<li>건조지질막이 형성될 때까지 60°C에서 45-60분 동안 진공 하에서 회전 증발기하에서 메탄올/클로로포형을 증발시킵니다.</li>
	<li>두 개의 주식 HEPES 버퍼 솔루션을 준비합니다. 20m HEPES(238.3g/mol)와 75m MM NaCl(58.44g/mol)을 혼합하여 HEPES 버퍼 1을 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. 20m HEPES 및 145m NaCl을 혼합하여 HEPES 버퍼 2를 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. HEPES 버퍼는 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. 참고: 진동계를 사용하여 버퍼의 진동을 확인하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>막 불투과성 형광염염수 커플을 용해시켜 지질 수분 공급 용액을 준비하고, 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic 산, 디나트륨 소금 12.5 mM (개미, 427.33 g/mol) 및 P 자일렌 바이스파이리디늄 브로마이드 45 mM (DPX, 422.16 g/mol) HEPES 완충액용. 개미와 DPX를 혼합하면 노란색 용액이 나타납니다. 12.5mM의 ANTS와 45mM의 농도를 달성하기 위해, HEPES 버퍼 1의 4mL에서 각각 21.4 mg 및 76 mg을 용해한다. 참고: 지질 수분 용액은 튜브를 알루미늄 호일로 래핑하여 4°C에서 2주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>지질 수분 공급 액액의 1mL로 건조지질필름을 재보습하고 건조지질필름의 용해될 때까지 소용돌이를 통해 다발성지질제(MLV)를 재구성한다. 작은 지질 응집체가 이전 단계에 부정적인 영향을 미치므로 용액이 완전히 용해되었는지 확인합니다. 또한 유리 원형 플라스크의 벽을 확인하여 남은 지질 필름이 없는지 확인하십시오. 참고: 용해도 가루 후 용액이 오팔레스센트와 밝은 노란색으로 나타납니다.</li>
	<li>단알라멜라 소포를 얻기 위해 5개의 동결/해동 사이클로 소포를 가치. 유리 원형 바닥 플라스크를 액체 질소에 30초 동안 넣고 해동 스텝을 위해 2분 동안 수조에 방치하여 각 주기를 수행합니다. 참고: 목욕물의 온도는 지질의 용융 온도보다 5-10°C 높아야 합니다.</li>
	<li>금속 압출기 캐니스터에 배치된 각 폴리테트라플루오로로틸렌(PTFE) 압출기 조각에 HEPES 버퍼로 예비 가습을 지원하는 2개의 필터를 삽입하여 지질 압출기 준비.</li>
	<li>HEPES 가습 폴리카보네이트 멤브레인(0.1 μm 모공 크기, 직경 25mm)을 하나의 필터 지지대 위에 놓습니다.</li>
	<li>두 개의 금속 압출기 캐니스터를 조립하고 나사.</li>
	<li>조립된 압출자를 홀더에 놓고 각 폴리테트라플루오로틸렌 압출기 조각의 사지에 적절한 구멍에 1mL 주사기를 넣습니다. 압출은 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 한 주사기에서 다른 주사기로 테스트된 액체의 통과에 해당한다.</li>
	<li>압출기를 1mL 주사기 중 하나에 로드한 HEPES 버퍼 1mL로 압출기를 테스트하여 누출이나 문제가 발생하지 않도록 합니다.</li>
	<li>1mL HEPES 버퍼를 MLV 샘플로 바꿉니까.</li>
	<li>동일한 크기의 균일한 LUV를 얻기 위해 적어도 21회 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 한 주사기에서 다른 주사기에서 다른 주사기로 MLV 샘플을 전달하여 압출을 수행합니다. 참고: 압출은 지질 혼합물의 용융 온도보다 높은 온도에서 수행되어야 합니다.</li>
</ol>2. 루브의 정화
<ol><li>캡슐화되지 않은 개미및 DPX 초과를 제거하기 위해 컬럼 정화를 준비합니다.</li>
	<li>액체 크로마토그래피 컬럼(Luer Lock, Non-jacketed, 1.0cm x 20cm, 침대 볼륨 16mL)에서 0.01% NaN 3(65g/mol)로 수성 배지에서 재장매된 크로스 링크 덱스펜 젤(G-50)을 열의 무색 부분의 상단 아래 1cm까지 소개합니다.</li>
	<li>탭을 열고 액체 흐름이 교차 연결된 dextran 젤을 해결하도록 합니다.</li>
	<li>HEPES 버퍼 2의 20mL로 용례하여 컬럼을 세척하고 열의 출력 흐름을 폐기합니다.</li>
	<li>열 위의 용매의 죽은 부피가 최소화되면 탭을 닫지만(<100 μL) 교차 연결된 dextran 젤의 건조를 피하기에 충분합니다.</li>
	<li>새로 압출된 LUV(노란색)를 기둥에 놓고 교차 연결된 덱스펜 젤에 들어갑니다.</li>
	<li>LUV 정제를 수행하기 위해 지속적으로 열에 HEPES 버퍼 2를 추가합니다.</li>
	<li>ELute 약 2 mL의 HEPES 버퍼 2 (정기적으로 교차 연결된 dextran 젤 건조를 피하기 위해 컬럼의 상단을 채우는 것을 잊지 마세요): 무료 노란색 ANTS 및 DPX 용액은 리포솜보다 느리게 마이그레이션됩니다.</li>
	<li>튜브(1.5mL)에서 정제된 LUV를 수집하기 시작합니다.</li>
	<li>기둥에서 용출방울을 관찰하고 오팔레인이 될 때, 그들은 리포솜을 포함합니다. 튜브를 변경하여 LUV 함유 분수를 복구합니다.</li>
	<li>방울이 더 이상 오팔레이트(~1mL)가 될 때까지 엘루트. 그 후, 별도의 분획에 또 다른 0.5 mL을 엘테한 다음 발례를 중지합니다. 참고: 표준은 이제 LUV의 용출 량을 보정하기 위해 키트 또는 개별 분자량으로 광범위한 분자량에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>형광 염료의 표백을 피하기 위해 알루미늄 호일에 LUV로 튜브를 감쌉니까.</li>
	<li>20mL HEPES 버퍼 2로 컬럼을 세척합니다.</li>
	<li>그런 다음 LUV를 4°C에서 일주일 동안 저장할 수 있습니다. 참고: LUV 안정성은 LUV 농도 및 컴포지션뿐만 아니라 이온 강도에 따라 달라질 수 있기 때문에 동적 광 산란(DLS) 계측기(섹션 4 참조)를 사용하여 LUV의 크기를 제어해야 합니다. 각 테스트 전에 LUV 크기 및 균질성의 특성화.</li>
</ol>3. LUV의 농도 를 정량화
<ol><li>콜린농도(19)의평가를 가능하게 하는 인지질 정량화 키트에 의한 LUV 농도추정. 이 분석법은 극지 헤드를 포함하는 콜린을 가진 인지질이 상당할 때 적용될 수 있습니다 (>50% LUV의).</li>
	<li>제공된 완충제의 3mL에서 염색체 기판 18 mg을 용해하여 색 시약을 준비합니다.</li>
	<li>폴리스티렌 큐벳, 10 x 10 x 45mm, 3mL의 컬러 시약을 로드합니다.</li>
	<li>순수한 색상 시약을 빈 상태(공백)로 사용합니다. 알려진 콜린 농도(표준)의 표준 용액의 LUV 샘플(Test) 또는 20 μL의 20 μL을 추가합니다.</li>
	<li>잘 섞고 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오 모든 조건 (공백, 테스트 및 표준).</li>
	<li>스펙트로포토미터를 사용하여 600 nm의 제어로서 빈 용액을 사용하여 테스트 샘플 및 표준 용액의 흡광도(광학 밀도, OD)를 측정합니다.</li>
	<li>알려진 농도의 표준에 비해 콜린에 상응하는 LUV, C[LUV]의 지질 농도를 추정할 수 있는 OD 값을 확인합니다.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 계산을 수행합니다. C[LUV] (mol/l) = (OD 샘플/OD 표준) x C[표준] (mol/l) 참고: 인지질 정량화 키트는 C[표준]= 3.87mmol/L. OD 샘플 및 OD 표준의 어금니 농도에 해당하는 54 mg/dL에서 콜린 염화물(139.6 mg/l) 표준 용액을 제공하였다.</li>
</ol>4. LUV 크기와 균일성의 특성화
<ol><li>LUV 크기(nm) 및 다분산 지수(PdI)를 결정하기 위해 DLS 계측기를 사용하여 측정을 수행합니다.</li>
	<li>용매/버퍼 및 사용된 큐벳의 점도를 표시하여 적절한 "표준 작동 절차"(SOP)를 프로그래밍합니다.</li>
	<li>폴리스티렌 세미 마이크로 큐벳에 LUV 용액의 500 μL을 배치합니다.</li>
	<li>폴리스티렌 세미 마이크로 큐벳을 DLS 기기에 삽입합니다.</li>
	<li>실온에서 입자 분포의 평균 크기(Z-평균) 및 균질성(다분산지수, PdI)의 크기 분포를 측정합니다.</li>
	<li>모든 결과는 세 번의 반복사이클에서 각각 수행되는 두 개의 독립적인 측정에서 얻어진다. 참고: LUV의 표준 값은 137± 7nm의 평균 크기로, PdI는 0.149 ± 0.041입니다.</li>
</ol>5. 펩타이드 솔루션 준비
<ol><li>누설 분석에 대해 분석해야 하는 펩타이드의 스톡 용액을 준비한다.</li>
	<li>퓨어 워터(예: 500 μL 순수 수의 1 mg 펩타이드)에 펩타이드 분말(>95% 순도)을 용해하십시오. 참고: 순수한 물에 펩티드를 희석시키고 디메틸 설옥화물(DMSO) 용용화를 방지하여 유물(예를 들어 막 과미빌라이징20)을유도하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>5s용 펩타이드 용액을 소용돌이시다.</li>
	<li>펩타이드 용액을 5분 간 초음파 처리한 다음 원심분리기는 12,225 x g에서5분 동안 초음파 처리합니다. 농도 측정을 위해 상체를 수집합니다.</li>
	<li>3개의 독립적인 펩티드 희석제의 280nm에서 흡광도를 측정한 다음, 어금니 소멸 계수 ε(펩티드 서열의 트립토판 및 티로신 함량에 따라 다름)과 비어-램버트 규칙을 사용하여 펩티드 농도를 계산한다. 참고: 펩타이드가 트립토판과 티로신을 포함하는 경우, 어금니 소멸 계수 ε 트립토판 ε 기초하여 계산됩니다 = 5,690 M-1cm-1cm 및 티로신 ε = 1,280 M-1cm-1. 펩티드 서열에 트립토판 또는 티로신이 포함되어 있지 않으면 다른 색분석 분석이 농도(예를 들어, BCA 또는 브래드포드)를 측정하기 위해 수행될 수 있다.</li>
	<li>펩티드 용액을 순수 한 물로 희석하여 100 μM의 최종 용액으로 희석하고 4 °C에 저장하십시오. 참고: 순수한 물에서는 4°C 저장 중에 펩티드 분해가 발생하지 않습니다. 그러나, 펩티드 농도는 물 증발이 발생하지 않도록 2주마다 측정되어야 한다.</li>
</ol>6. 형광 누출 분석
<ol><li>형광 누설 분석법은 실온에서 분광성계에서 측정됩니다. 흥분 및 방출 파장은 Ex = 360 nm ± 3 nm 및 Em = 530 nm ± 5 nm로 고정됩니다.</li>
	<li>1 mL HEPES 버퍼 2에서 석영 형광 큐벳에서 100 μM의 최종 농도로 LUV를 희석하십시오. 실험 중에 용액을 균질화하기 위해 자기 교반기를 추가합니다.</li>
	<li>배경 형광에 액세스하기 위해 t = 0 s와 t = 99 s 사이의 첫 100 s 동안 혼자 LUV를 측정합니다. 참고: 배경 형광 및 잠재적 누출에 액세스하기 위해 전체 실험(15분) 중에 LUV만 측정할 수 있습니다.</li>
	<li>그 후, 다음 900s(15분)에 대한 펩타이드 용액의 알리쿼트 첨가 시 형광 강도의 증가로 누설을 측정한다. 이 프로토콜은 0.1 μM에서 2.5 μM로 테스트된 펩티드의 각 농도에 대해 수행됩니다.</li>
	<li>마지막으로, 트리톤 X-100(0.1%, v/v)의 1μL을 추가하여 LUV를 용해시킴으로써 100% 형광을 달성하여 t = 1,000s 및 t = 1,100s 사이의 완전히 압축되지 않은 프로브를 생성하였다.</li>
</ol>7. 누출의 정량화
<ol><li>각 테스트된 조건에 대해 동일한 수의 점을 유지하기 위해 t = 1,090s 후에 얻은 값을 억제합니다.</li>
	<li>t = 0 s와 t = 49 s (혼자 LUV) 사이의 50 점의 평균을 만들어 최소한의 형광, Fmin을계산합니다.</li>
	<li>t = 1,041s와 t = 1,090 s (트리톤 X-100의 LUV) 사이의 평균 50 점을 만들어 최대 형광, F최대를계산합니다.</li>
	<li>다음 방정식에 따라 각 시점(t = x)에서 누설 비율(%누출)을 계산합니다. %누출(t =x) = (F(t = x) - F분) / (F최대 - F분)x 100</li>
	<li>동일한 조건에 대해 다른 LUV 준비(n ≥ 2)로 얻은 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다.</li>
	<li>누설 비율,%누설(t=x)시간 함수를 플롯합니다.</li>
</ol>

<ol>
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Binding mechanism and thermodynamic analysis.</a> Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).</li><li>Thor&#233;n, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nord&#233;n, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antennapedia+peptide+penetratin+translocates+across+lipid+bilayers+-+the+first+direct+observation.">The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation.</a> FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+HIV+TAT+peptide+and+analogues+induced+by+multiplexed+membrane+and+cytoskeletal+interactions.">Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).</li><li>Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+thin+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).</li><li>Bartlett, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+assay+in+column+chromatography.">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li><li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate.">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li><li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles.">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).</li><li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity.">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li><li>B&#225;r&#225;ny-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gr&#228;slund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo.">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li><li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+permeabilization+by+oligomeric+&#945;-Synuclein:+in+search+of+the+mechanism.">Membrane permeabilization by oligomeric &#945;-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292 (2010).</li><li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides.">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li><li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles.">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).</li><li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins.">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li></ol>

저자는 이해상충이 없습니다.

제시된 형광 누설 분석법은 세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 해결하는 간단하고 빠른 방법입니다. 쉽게 할 수 있으며, 또한 다른 멤브레인 상호 작용 펩티드 또는 다른 멤브레인 상호 작용 분자 사이의 간접적인 비교를 가능하게합니다. 이 분석이 기준선(LUV 단독으로)과 최대 형광 방출(Triton 조건) 사이의 상대적 값을 제공하기 때문에 프로토콜의 중요한 단계에 대해서는 일반적으로 LUV?...

90년대에 발견된 후, 세포 관통 펩티드(CpP)는 혈장 막1,2를통해 화물의 효율적인 세포 전달을 촉진하기 위해 개발되었다. CpPs는 일반적으로 짧은 펩티드, 일반적으로 8 ~ 30 아미노산, 기원의 다양 한 데. 그(것)들은 처음에 "직접 배분하는" 운반체로 정의되었습니다, 그(것)들이 플라즈마 막을 교차하고 에너지 요구 사항도 수용체 관여도 없는 어떤 내분 통로와 독립적으로 세포로 화물을 전송할 수 있었다는 것을 의미합니다. 그러나, 추가 조사는 이러한 첫 번째 관찰이 주로 실험 동맥 및 /또는 메탄올3을사용하여 고정 프로토콜에 형광 과대 평가에서 온 것으로 나타났다. 요즘CPP 섭취량은 내분세포증과 에너지 독립적인 전좌4,5,6,7 이에 따라 화물의 특성, CPP와 화물 간의 사용 링크, 연구된 세포주 등과 같은 다른 파라미터에 따라 이루어지는 것으로 널리 받아들여지고 있다.
CPP는 CPP와그 화물8,9,10,11사이의 화학 링크(covalent strategy) 또는 정전기/소수성 상호 작용(비-공유 전략)을 포함하는 두 가지 전략에 따라 경전제로서 사용될 수 있다. 두 전략 모두 여러 화물의 세포 전달에 효율성을 보였지만, CPP에 의한 내산화 메커니즘에 대한 이해는 여전히 논란의 여지가 있으며 내분비 경로 또는 직접 침투 사이의 균형은 여전히12,13을측정하기 어렵다. 일련의 실험 도구와 전략이 내막 프로세스의 개입을 명확하게 해결할 수 있지만, 직접 전좌는 플라즈마 멤브레인 구성 요소와의 보다 이산적인 상호 작용을 의미하기 때문에 특성화하기가 더 어려워 보입니다. 생물학적 막은 일반적으로 세포 유형 및/또는 환경(스트레스 조건, 세포 분열 등)에 따라 달라질 수 있는 인지질에서 막 단백질에 이르기까지 수많은 성분으로 구성됩니다. 이러한 구성의 다양성, 따라서 보편적인 세포막 모델의 부재는 한 가지 방법으로 연구를 가능하게 하지 않는다. 그러나 이러한 한계를 우회하기 위해 단계별 접근법은 인공 막 또는 멤브레인 추출물로 개발되었다. 작은 unilamellar 소포에서 단층 접근법에 이르기까지 모든 모델은 특정 질문에14,15에분명히 답하는 데 관련이 있었습니다. 그 중에서도, 큰 unilamellar 소포 (LUV)는 내재화 프로세스의 핵심 포인트인 펩티드 /멤브레인 상호 작용을 연구하기 위한 적절한 멤브레인 모방 모델을 구성한다.
이러한 맥락에서, 다음 프로토콜은 음이온 형광염과 리포솜에 캡슐화된 해당 다양양이온 담수의 모니터링을 통해 LUV 무결성에 대한 펩타이드 및 펩타이드/멤브레인 상호 작용의 영향에 대한 조사를 설명합니다. 이 도구는 직접 멤브레인 전좌를 수행 할 수 있는지 여부를 이해하기 위해 CPP / 멤브레인 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 일반적으로 다른 멤브레인 상호 작용 펩티드를 비교하기 위해 적용되었지만,이 LUV 형광 누설 분석은 CPP-화물 공자 (공유 전략)와 CPP :화물 단지 (비 공유 전략)를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
따라서 본 프로토콜은 최근에 개발된 트립토판(W)과 아르기닌(R)이 풍부한 수륙요법 펩타이드(WRAP)16과함께 먼저 예시된다. WRAP은 펩티드 계 나노입자를 형성하여 여러세포주(16)에서소형 간섭 RNA(siRNA)를 신속하고 효율적으로 전달할 수 있다. WRAP 펩티드 단독으로 또는 siRNA-로드 WRAP 계 나노입자의 형광 누설 특성을 모니터링하여 세포 내산화의 메커니즘을 특성화하였다. 우리는 내면화의 그들의 기계장치가 주로 직접 전좌7을관련시키는 것을 보여주었습니다. 두 번째 예에서, WRAP 펩타이드는 단백질/단백질 간섭 펩타이드 iCAL36(WRAP-iCAL36)17에 공유하게 되었고, 그 능력은 형광 누설 분석에서 페네타틴(Penetratin-iCAL36), 또 다른 CPP에 결합하였다.
마지막으로, 방법의 장점과 한계는 기술적 관점에서 생물학적 관련성에 대해 모두 논의될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>25 mL glass round-bottom flask</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Phospholipid&amp;nbsp;</td><td>WAKO&amp;nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>liquid chromatography column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 &amp;micro;m pore size, 25 mm diameter)</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene semi-micro cuvette, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Protect from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>quartz fluorescence cuvette</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>rotavapor system&amp;nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 resin</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bath USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Protect from air</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&amp;nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide

세포 관통 펩티드(CpP)는 플라즈마 멤브레인을 교차하고 화물을 세포로 이송할 수 있는 운반체로 정의됩니다. 이 활동에 필요한 주요 일반적인 특징 중 하나는 플라즈마 멤브레인 (지질)과 CPP의 상호 작용및 특히 막 자체의 세포 외 매트릭스 (heparan sulphate)의 구성 요소에서 비롯되었습니다. 실제로, 직접적인 전좌 또는 내분비에 의존하는 내재화와는 별개로, 지질 이중층은 혈장 막의 수준과 세포내 교통(내외 소포)의 수준에서 모두 내화 공정에 관여한다. 이 문서에서는 가능한 CPP 멤브레인 불안정화/상호 작용을 감지하고 내부화 메커니즘에서 자신의 역할을 해결하기 위해 형광 누설 분석에서 큰 단음제 소포(LUV) 제제, 정제, 특성화 및 응용 프로그램의 다른 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 혈장 막 함량을 반영하는 지질 조성물을 가진 루프는 형광염과 담수를 모두 캡슐화하기 위해 생성된다. 루프염증에 대한 펩티드-멤브레인 상호작용의 외과 배지에 펩타이드를 첨가하고 따라서 투여량 의존적 방식으로 유도하여 누설을 드러내는 형광의 현저한 증가를 유도할 수 있다. 최근에 개발된 트립토판(W)과 아르기닌(R)이 풍부한 수륙양용 펩타이드(WRAPP)와 함께 다양한 세포주에서 신속하고 효율적인 siRNA 전달을 보여 준 사례가 여기에 제공된다. 마지막으로, 이러한 상호 작용의 본질과 지질에 대한 친화력은 막 전좌 및/또는 내인성 탈출을 이해하고 개선하기 위해 논의됩니다.

형광 누설 분석의 원리는 도 1에도시된다. 구체적으로, 형광염과 담수(형광 신호 없음)를 캡슐화하는 대형 유니라멜라 소포(LUV)는 관심있는 생체 분자로 처리된다. 막 투과성, 재구성 또는 파열을 암시할 수 있는 지질 막과의 펩타이드의 상호 작용으로 인해 형광염과 담종은 LUV에서 방출됩니다. 버퍼의 후속 희석으로 인해 형광 신호가 증가합니다....

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Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

형광 누설 분석법은 펩타이드/멤브레인 상호작용의 조사를 가능하게 하는 간단한 방법으로, 여러 생물학적 과정에 대한 그들의 관여, 특히 세포 관통 펩타이드의 능력을 이해하기 위해 직접 세포 전좌 과정 동안 인지질을 방해한다.

세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누설 분석

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.2K 조회수.  INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier. 형광 누설 분석법은 펩타이드/멤브레인 상호작용의 조사를 가능하게 하는 간단한 방법으로, 여러 생물학적 과정에 대한 그들의 관여, 특히 세포 관통 펩타이드의 능력을 이해하기 위해 직접 세포 전좌 과정 동안 인지질을 방해한다.

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Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

생물학적 장벽의 침투 강화를 위한 순환 세포 침투 펩타이드의 구성

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

연구

화학

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

면역학 및 감염병학

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

생물학

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

Source: Guo, L. et. al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

형광 마이크로플레이트 기반 시클로헥시미드 추적 분석: 형광 핵 잘못 접힌 단백질의 분해 역학을 모니터링하는 기술

Source: Guo, L. et. al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016)
This video describes an in vitro ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Biochemical assays

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하기 위한 형광 펩타이드 절단 분석

1. Designing and Preparing the Peptides

	Acquire the sequence of the fusion protein of interest from a public database such as NCBI ...

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

Fluorescence Leakage Assay to Study Cell-Penetrating Peptide Interaction with Membrane

Source: Konate, K. et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/62028">Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video discusses the fluorescence leakage assay to study the interactions of cell-penetrating peptides with cell membranes using cell membrane mimics &#8212; large unilamellar vesicles, or LUVs, encapsulated with a fluorescent dye and a quencher.

세포를 투과하는 펩타이드와 멤브레인의 상호작용을 연구하기 위한 형광 누출 분석

Source: Konate, K. et al. Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide. J. Vis. Exp. (2020)
This video ...

세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누설 분석

요약

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