우리는 프라이머 개발 및 테스트에 도움이 알비 와두드와 트루디 프로스트 감사합니다. 이 연구에서 보고된 분석 설계에 대한 자금은 국방부 전략 환경 연구 개발 프로그램(RC19-1156)에 의해 제공되었습니다. 무역, 제품 또는 회사 이름을 사용하는 것은 설명적인 목적으로만 사용되며 미국 정부의 승인을 의미하지는 않습니다. 이 연구 기간 동안 생성된 데이터는 USGS 데이터 릴리스 https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 사용할 수 있습니다.

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 자금 지원은 연구의 디자인에 아무런 역할이 없었다; 데이터의 수집, 분석 또는 해석에서; 원고의 글에서; 또는 결과를 게시하기로 결정합니다.

어떤 연구와 마찬가지로, 해결될 질문을 정의하는 것은 첫 번째 단계이고 eDNA 분석의 디자인은 연구 결과에 따라 다릅니다26. 예를 들어, 연구 또는 조사의 목적이 하나 또는 몇 가지 종을 검출하는 경우, 표적 프로브 기반 분석이 가장 좋습니다. 그러나, 목표는 더 큰 제품군 또는 종의 조립을 평가하는 것입니다 경우, 높은 처리량 시퀀싱 메타바코딩 분석이 더 적합합니다. 어떤 접근 방식을 취해야 할지 결정되면 분석 설계, 테스트 및 최적화를 포함한 파일럿 연구가 권장됩니다.24. 분석 설계는 에 설명된 대로 종 목록으로 시작됩니다. 그림 1. 이 목록은 분석이 특이성과 적용될 수 있는 지리적 범위측면에서 얼마나 잘 수행되는지 를 이해하는 기초가 될 것입니다.6,10. 특정 지리적 영역에 대한 분석기를 설계하여 설계하여 설계자가 해당 지역의 다른 종에 대한 상호 반응성에 대한 분석방법을 더 잘 테스트할 수 있으며, 표적 종이 발생할 수 있는 다른 지역으로 분석영역을 확장하는 데 있어 한계를 인식하는 것이 좋습니다.24. 목록이 완료되면 공개 유전 데이터베이스에서 시퀀스를 다운로드할 수 있습니다. 이러한 데이터베이스가 불완전하기 때문에27, 하나는 분석 설계에 사용되는 시퀀스의 로컬 참조 데이터베이스를 완료하기 위해 집에서 가능한 한 많은 종을 순서해야합니다. 이들은 증폭할 가능성이 가장 높은 비 표적이기 때문에, 밀접하게 관련되는 종을 공동 발생하는 우선순위를 정합니다. 대상 종과 같은 속 또는 가족 내의 모든 종에 초점을 맞추는 것은 시작하기에 좋은 장소입니다. 밀접하게 관련 된 종과의 비교는 대상 종에 고유한 서열 영역을 식별하는 데 도움이됩니다. 이렇게 하면 다른 시스템이나 위치에서 분석이 어떻게 수행되는지 알 수 있습니다. 미토콘드리아 영역은 종개발의 일반적인 선택이며, 생명 프로젝트의 바코드에 사용된 미토콘드리아 유전자에서 보다 다양한 종의 서열 정보를 사용할 수 있기 때문에, 미토콘드리아 DNA는 핵 DNA보다 사본/세포에 훨씬 더 큰 농도로 존재하기 때문이다.24,28,29. 여러 유전자 영역은 유전 저장소 데이터베이스에서 분류사 마다 서열 엄호가 변화하기 때문에 추가 분석 발달을 위해 평가되어야 합니다. 참조 시퀀스의 이 로컬 데이터베이스가 생성되면 정렬된 시퀀스 데이터와 컴퓨터 소프트웨어 프로그램의 수동 시각화가 결합되어 프라이머/프로브 분석방법을 디자인하는 데 사용됩니다. 하나는 테스트 할 분석방법을 결정하기 위해 소프트웨어에 엄격하게 의존해서는 안됩니다. 프라이머와 프로브가 대상과 비대상에 앉아 있는 정렬을 시각적으로 확인하여 PCR에서 어떻게 행동할지 더 잘 이해하는 것이 중요합니다. 마지막으로 분석 검사 및 최적화는 세 가지 수준을 포함 (실리코에서, 시험관 내 및 시투에서)6,7,24,25. 실리코 디자인 및 테스트는 성공 가능성이 좋은 짧은 분석 목록을 생성하는 데 중요하지만 경험적 (시험관 내) 테스트는 최상의 실제 성능으로 분석기를 선택하는 데 중요합니다. 시험관 내 최적화 및 분석 테스트에는 반응 효율을 측정하고 분석의 민감도 및 특이성을 정의하는 것이 포함됩니다. 검출 및 정량화의 한계는 분석 개발에서 간과되는 두 가지 매개 변수이지만 데이터 해석에 중요합니다. 분석에 대한 표준 곡선의 여러 복제를 실행함으로써 LOD 및 LOQ를 쉽게 측정할 수 있습니다.1,5,30. 분석의 LOD 또는 LOQ와 관련하여 결과를 논의하는 연구는 거의 없지만, Sengupta 외(2019)는 분석의 LOD 및 LOQ를 데이터 해석 및 그래픽에 통합하여 결과를 보다 명확하게 이해하기 위한 것입니다.31. 내부 양수 컨트롤도 설계된 분석서에 멀티플렉션되어야 합니다. 샘플에서 PCR 억제에 대한 테스트없이, 거짓 네거티브가 발생할 수 있습니다24,32. 우리는 PCR 억제 테스트를위한 가장 쉬운 방법으로 대상 분석과 멀티 플렉스 IPC 분석의 사용을 제안23. 마지막으로, 환경 샘플에서 표적 증폭이 발생하는지 확인하기 위해 현장 및 실험실 에서 수집된 샘플의 분석 현장에서 분석이 필요합니다.24.
eDNA 샘플을 사용하여 종별 프로브 기반 qPCR 분석기의 사용에 대한 제한이 존재합니다. 예를 들어, 테스트를 위한 여러 분석서의 설계는 시퀀스 가용성에 의해 제한될 수 있으며 분석 성능측면에서 타협이 필요할 수 있습니다. 이러한 선택은 연구의 목표에 의해 인도되어야하며 결과26과함께보고해야합니다. 예를 들어, 희귀 종을 검출하는 것이 목표이고 몇 가지 양성이 예상되는 경우, 모든 검출이 시퀀싱에 의해 확인될 경우 불완전한 특이성(즉, 비표적 종의 증폭)을 가진 분석이 사용될 수 있다. 목표가 종의 지리적 범위를 모니터링하고 eDNA 농도 데이터가 필요하지 않은 경우 불완전한 효율성을 가진 분석이 사용될 수 있으며 데이터는 백분율 검출으로만 보고될 수 있습니다. 더욱이, 모든 잠재적인 동특이성이 실험실에서 시험되지 않는 한, 거의 가능하지 않습니다, 하나는 절대적으로 확실하게 분석의 진정한 특이성을 알 수 없습니다. 예를 들어, 분석은 클린치 강의 여러 담수 홍합 종에 대해 설계 및 테스트되었습니다. 다른 강 시스템에서이 분석서를 사용하려면 새로운 위치에있는 종의 제품군에 대해 테스트해야합니다. 분석 발달 도중 시험되지 않는 종 또는 인구 내의 유전 변이는 또한 특이성에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, 분석이 높은 기술적 성능을 가지고 있는지 확인된 경우에도 현장에서 작업할 때 조건이 바뀝니다. 물 흐름, pH 및 동물 거동과 같은 비 분석 관련 조건은 상이한 eDNA 수집 및 추출 프로토콜을 사용할 수 있는 바와 같이 eDNA 검출가능성을 바꿀 수 있다. 최적화되고 잘 설명된 분석에 사용하면 이러한 매개 변수가 eDNA 검출에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 됩니다.
eDNA 분야는 탐색 분석 단계를 넘어 방법과 기술의 표준화를 증가시키기 위해 성숙하고 있습니다. 이러한 발전은 eDNA 기술, 능력 및 한계에 대한 이해를 향상시킬 것입니다. 위에서 설명하는 최적화 프로세스는 분석의 민감도, 특이성 및 재현성을 향상시킵니다. eDNA 방법의 이 정제 및 표준화의 궁극적인 목표는 eDNA 데이터를 기반으로 추론을 하는 연구원의 능력을 향상시키고 최종 사용자 및 스테이크 보유자의 결과에 대한 신뢰를 높이는 것입니다.

연구원과 관리자는 점점 종 검출을 위한 환경 DNA 연구약의 사용에 관심을 지고 있습니다. 3년 동안, 정량적 또는 실시간 PCR(qPCR/rtPCR)은 핵산1,2의서열 특이적 검출 및 정량화를 위해 수많은 분야에서 사용되어 왔다. eDNA 연구의 비교적 새로운 분야 내에서, 이러한 검사의 사용은 부피 또는 eDNA 샘플의 무게당 표적 DNA의 사본을 정량화하기 위한 표준 곡선을 가진 이 애약의 사용이 이제 일상적인 사례가 되었습니다. 미토콘드리아 DNA 서열은 일반적으로 미토콘드리아 게놈이 세포당 수천 개의 사본에 존재하기 때문에 eDNA 분석은 일반적으로 표적으로 하지만 핵 DNA 또는 RNA 서열에 대한 분석은 또한 가능하다. eDNA 샘플에 대한 출판 된 소가 항상 성능과 동일하지 않다는 것을 이해하는 것이 중요합니다. 표적 종의 DNA(즉, 특이성)만 검출하고 표적 DNA(즉, 감도)의 검출에 대한 분석의 신뢰성은 분석이 설계, 선택, 최적화 및 테스트된 방식의 차이로 인해 상당히 달라질 수 있다. 분석 성능의 정량적 측정을 보고하는 것은 이전에 크게 간과되었지만, 최근 분석 개발의 투명성을 개선하기 위한 표준이3,4,5,6,7,8로부상하고있다.
eDNA 조사 결과의 연구 설계 및 해석에 대한 분석 성능 보조 제의 최적화 및 보고. 비표적 종 DNA와 교차 반응하는 분석은 거짓 양성 검출으로 이어질 수 있으며, 민감성이 좋지 않은 분석법은 샘플(거짓 네거티브)에 존재하는 경우에도 표적 종 DNA를 감지하지 못할 수 있습니다. 분석 민감도 및 선택성에 대한 이해는 희귀 종을 검출하는 데 필요한 샘플링 노력을 알리는 데 도움이 됩니다. eDNA에 변화의 많은 자연적인 소스가 있기 때문에, 연구는 완전히 최적화하고 eDNA 분석3을특성화포함, 가능한 한 변이의 제어 가능한 소스를 제한해야합니다.
분석기의 특이성 또는 감도에 직접적인 영향을 주는 조건은 분석기의 성능을 변경합니다. 이것은 다른 실험실 조건 (즉, 다른 시약, 사용자, 기계 등)에서 발생할 수 있습니다. 따라서 새 조건에서 분석서를 적용할 때 이 프로토콜을 다시 검토해야 합니다. 문헌에서 잘 특징지어지는 소법조차도 새로운 실험실에서 채택하거나 다른 시약(예를 들어, 마스터 믹스 용액)을 사용할 때 테스트및 최적화되어야 한다5,9. 분석 특이성은 상이한 지리적 영역에 적용될 때 변경될 수 있으며, 분석이 시험되지 않은 비표적 종을 포함할 수 있는 새로운 바이오틱 커뮤니티로부터의 샘플에 적용되고 있기 때문에 표적 종의 유전적 변화가 발생할 수 있다. 다시 말하지만, 분석은 새 위치에서 사용할 때 다시 평가되어야 합니다. 현장 PCR 억제제는 샘플에 존재할 가능성이 높기 때문에 현장 조건은 실험실 조건과 다릅니다. PCR 억제제는 증폭 반응에 직접적인 영향을 미치고 따라서 분석 성능에 영향을 미칩니다. 이러한 이유로, 내부 긍정적인 제어 는 eDNA 분석 기 개발 시 필요.
마지막으로, 필드에 있는 환경 조건은 DNA 분해, 수송 및 보존을 통해 표적 종의 DNA 분자 및 그들의 포착에 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, DNA 수집 및 추출을 위한 다른 프로토콜은 DNA를 유지하는 그들의 효율성 그리고 기능에 변화합니다. 그러나 이러한 프로세스는 eDNA의 검출 가능성에 영향을 미치지만 분자 적 약의 성능은 아니라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 현장 샘플에서 표적 종으로부터의 DNA의 검출성은 qPCR 분석의 기술적 성능뿐만 아니라 현장 조건 및 수집, 저장 및 추출 프로토콜의 기능이다. 잘 특징적이고 성능이 높은 분석서를 사용하는 경우 사용자는 분석의 기능에 자신감을 느낄 수 있습니다. 연구원은 지금 eDNA 탐지에 영향을 미치는 외부 분석 요인 (즉, 환경 변수, 포획 또는 추출 프로토콜의 차이)를 이해하는 데 집중할 수 있습니다.
여기서우리는 엄격한 설계와 최적화를 통해 분석 기술 성능에 특히 중점을 둡니다. 우리는 미국 클린치 강에서 샘플링 된 물에서 담수 홍합, 머킷(액티논아 인대)의검출을 위해 개발 된 프로브 기반 분석법을 사용하여 프로토콜을 시연합니다. 최근 탈링거 외 (2020)는 표적 eDNA 검사의 검증을 위한 지침을 제출했습니다. 우리의 프로토콜에 따라 분석 디자인은 탈링거 등의 레벨 4플러스 레벨 56을향한 추가 단계에 대한 분석서를 가져올 것이다. 이 시점에서 분석의 기술 성능이 최적화될 것이며 실험실 및 현장 응용 분야에서 정기적으로 사용할 준비가 될 것입니다. 실험실, 중소균 및 현장 실험에서 분석법의 추가 사용은 eDNA 검출 및 검출가능성에 영향을 미치는 요인, 레벨 5 유효성 검사6의최종 단계에 관한 질문을 해결할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>96 Place Reversible Racks with Covers</td><td>Globe Scientific</td><td>456355AST</td><td></td></tr><tr><td>Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.)</td><td>Kimberly-Clark</td><td>43431, 55090</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>2681332</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td><td>Bio-Rad</td><td>#HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>IPC forward and reverse primers</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>IPC PrimeTime qPCR Probes</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates</td><td>Labnet</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge machine</td><td>Various</td><td>-</td><td>Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay.</td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 1000 &amp;micro;L F 768A/8</td><td>Rainin</td><td>30389272</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 20 &amp;micro;L F 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389274</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 200 &amp;micro;L F 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389276</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Rainin</td><td>Various</td><td>Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes.</td></tr><tr><td>TaqMan Environmental Master Mix 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4396838</td><td></td></tr><tr><td>Target forward and reverse primers</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>Target PrimeTime qPCR Probes</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>Target synthetic gBlock gene fragment</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product. used for qPCR standard dilution series</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER</td><td>Fisher Scientific</td><td>50728002</td><td></td></tr></tbody></table>

development and testing of species-specific quantitative pcr assays for environmental dna applications

수산 및 야생 동물 보호 관리를 돕기 위해 종의 존재를 감지하고 모니터링하기위한 새로운 비침습적 방법이 개발되고 있습니다. macrobiota를 검출하기 위한 환경 DNA(eDNA) 샘플의 사용은 급속히 인기를 끌고 국가 관리 프로그램에서 구현되고 있는 방법의 한 개이다. 여기서 우리는 프로브 기반 정량 PCR (qPCR) 응용 프로그램에 대한 종 별 표적 분석의 개발에 초점을 맞추고 있습니다. 프로브 기반 qPCR을 사용하면 프라이머만으로도 가능한 것보다 더 큰 특이성을 제공합니다. 더욱이, 샘플에서 DNA의 양을 정량화하는 능력은 eDNA의 생태학과 현장에서 eDNA 검출 패턴의 해석에 유용할 수 있다. 환경 샘플에서 대상 종을 검출하는 민감도 및 특이성을 보장하기 위해 이러한 아세의 개발 및 테스트에 주의 깊은 고려가 필요합니다. 이 프로토콜에서 우리는 표적 종의 검출을 위한 프로브 기반 분석서를 설계하고 테스트하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 시퀀스 데이터베이스, 분석 설계, 분석 선택 및 최적화, 테스트 분석 성능 및 필드 유효성 검사를 포함합니다. 이러한 단계를 수행하면 자신있게 사용할 수 있는 효율적이고 민감하며 구체적인 분석결과를 달성하는 데 도움이 됩니다. 우리는 미국 클린치 강에서 발견되는 담수 홍합 종인머켓(액티논나이아스 인대)의인구를 위해 고안된 분석으로 이 과정을 시연합니다.

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Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

환경 DNA 분석법은 현장 데이터 수집이 시작되기 전에 엄격한 설계, 테스트, 최적화 및 검증이 필요합니다. 여기서, 우리는 환경 샘플에서 표적 종 DNA의 검출 및 정량화를 위한 종별, 프로브 기반 qPCR 분석의 각 단계를 통해 사용자를 취할 프로토콜을 제시한다.

환경 DNA 응용을 위한 종별 정량PCR 분석의 개발 및 시험

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

development-testing-species-specific-quantitative-pcr-assays-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

12.7K 조회수.  U.S. Geological Survey. 환경 DNA 분석법은 현장 데이터 수집이 시작되기 전에 엄격한 설계, 테스트, 최적화 및 검증이 필요합니다. 여기서, 우리는 환경 샘플에서 표적 종 DNA의 검출 및 정량화를 위한 종별, 프로브 기반 qPCR 분석의 각 단계를 통해 사용자를 취할 프로토콜을 제시한다.

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A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석<em&gt; 엔테로 종.</em&gt;과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

연구

환경과학

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

실시간 PCR에 의한 연안 퇴적물 및 정량 16S의 rRNA의 유전자 및 성적 증명서에서 동시 DNA-RNA 추출

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

암 연구학

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

유전학

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA sequence variation on a large scale. Specifically, detecting insertions and deletions (indels) at gene-edited sites generated by CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-mediated non-homologous end-joining (NHEJ) is important for assessing the fidelity of the mutagenesis and the frequency of unintended changes. We describe here a protocol for digital-droplet PCR (ddPCR) that is well-suited for high-throughput NHEJ analysis. While this method does not produce data that identifies individual sequence variation, it provides a quantitative estimate of the sequence variation within a population. Additionally, with appropriate resources, this protocol can be implemented in a field-site laboratory setting more easily than next-generation or Sanger sequencing. ddPCR also has a faster turn-around time for results than either of those methods, which allows a more quick and complete analysis of genetic variation in wild populations during field trials of genetically-engineered organisms.

This protocol provides the steps from DNA extraction to experimental set-up for digital droplet PCR (ddPCR), including analysis for the identification and quantification of non-homologous end-joining (NHEJ) events at target sites following gRNA-induced Cas9 cleavage and DNA repair. Other uses of this method include applications such as polymorphism detection and gene-editing variant verification.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

이전 DNA의 정제없이 식물과 동물 샘플의 Genotyping

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

생물학

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

low-MW DNA를 농축하여 환경 AMR을 평가하기 위한 효율적인 기법

Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has emerged as the source of choice to sample pathogen burdens in the environment. Wastewater from open drains and community water treatment plants is a reservoir of both pathogens and antimicrobial resistance (AMR) genes, and frequently comes in contact with humans. While there are many methods of tracking AMR from water,&#160;isolating good-quality DNA at high yields from heterogeneous samples remains a challenge. To compensate, sample volumes often need to be high, creating practical constraints. Additionally, environmental DNA is frequently fragmented, and the sources of AMR (plasmids, phages, linear DNA) consist of low-molecular-weight DNA. Yet, few extraction processes have focused on methods for high-yield extraction of linear and low-molecular-weight DNA. Here, a simple method for high-yield linear DNA extraction from small volumes of wastewater using the precipitation properties of polyethylene glycol (PEG) is reported. This study makes a case for increasing overall DNA yields from water samples collected for metagenomic analyses by enriching the proportion of linear DNA. In addition, enhancing low-molecular-weight DNA overcomes the current problem of under-sampling environmental AMR due to a focus on high-molecular-weight and intracellular DNA. This method is expected to be particularly useful when extracellular DNA exists but at low concentrations, such as with effluents from treatment plants. It should also enhance the environmental sampling of AMR gene fragments that spread through horizontal gene transfer.

저자 스포트라이트: 배양 기반 기법과 유전체학을 결합하여 환경적 항생제 내성의 이해 및 검출

Here, we present a simple technique to assess environmental antimicrobial resistance (AMR) by enhancing the proportion of low-molecular-weight extracellular DNA. Prior treatment with 20%-30% PEG and 1.2 M NaCl allows detection of both genomic and horizontally transferred AMR genes. The protocol lends itself to a kit-free process with additional optimization.

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화 

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has ...

환경 DNA 응용을 위한 종별 정량PCR 분석의 개발 및 시험

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동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석

실시간 PCR에 의한 연안 퇴적물 및 정량 16S의 rRNA의 유전자 및 성적 증명서에서 동시 DNA-RNA 추출

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

이전 DNA의 정제없이 식물과 동물 샘플의 Genotyping

내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화