Name: phosphoproteomic strategy for profiling osmotic stress signaling in arabidopsis
Uploaded: 2020-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis at JoVE.com

이 작품은 중국 과학 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램, 그랜트 XDB27040106에 의해 지원되었다.

1. 샘플 준비
<ol><li>알루미늄 호일에 대조군 및 응력 처리 모종(1g)을 수확하고 액체 질소로 샘플을 동결시한다. 참고: 단백질 농도가 높은 것은 일반적으로 성숙한 식물에서 보다 2 주 오래 된 모종에서 관찰. 모종의 한 그램은 MS 분석에 충분 한 단백질 lysate의 약 10 mg을 생성 합니다. 모든 원심 분리 단계는 1단계에서 16,000 x g에서 수행됩니다.</li>
	<li>냉동 모종을 박격포와 액체 질소로 채워진 유봉을 사용하여 미세 한 분말로 갈아 냅니다.</li>
	<li>용해 버퍼 1mL 추가(100mM Tris-HCl에서 6M 구니딘-HCl, pH 8.5) 10mM Tris (2-carboxyethyl)인 포스핀 염산염(TCEP), 40mMM 2 클로로아세타미드(CAA), 프로테아제 억제제 및 인산 억제제 칵테일을 박격포에 넣고 유봉의 도움으로 혼합한다.</li>
	<li>식물용 용액을 1.5mL 튜브로 옮기고 95°C에서 5분 동안 가열합니다.</li>
	<li>튜브를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 얼음 에 튜브를 10 초 동안 초음파 처리하고 10 초 동안 일시 중지하고 세 번 반복합니다.</li>
	<li>원심 분리는 20 분 동안 튜브를 원심 분리하고 식물의 150 μL을 1.5 mL 튜브로 lysate.</li>
	<li>튜브에 100% 메탄올의 600 μL을 추가합니다. 소용돌이와 튜브 아래로 회전.</li>
	<li>튜브에 100% 클로로폼의 150 μL을 추가합니다. 소용돌이와 튜브 아래로 회전.</li>
	<li>튜브에 ddH2O의 450 μL을 추가합니다. 소용돌이와 원심분리기는 3분 동안 튜브를 분리합니다.</li>
	<li>상부 수성 층을 폐기합니다. 튜브에 100% 메탄올의 600 μL을 추가합니다. 튜브를 3분 동안 원심분리한 다음 용액을 폐기합니다.</li>
	<li>단백질 펠릿을 100% 메탄올의 600 μL로 세척합니다. 용액을 버리고 단백질 펠릿을 공기 건조시십시오.</li>
	<li>단백질 펠릿을 소화 완충제 600μL로 재차 스펜싱(12mM 나트륨 탈옥초레이트(SDC)/12m 나트륨 라우로일 사르코시나테(SLS)에서 100mM Tris-HCl, pH 8.5)로 재차한다. 서스펜션이 균질화 될 때까지 튜브를 초음파 처리합니다.</li>
	<li>BCA 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하고 소화 완충액으로 농도를 4 μg/μL로 조정합니다. 용사(400 μg 단백질)의 100 μL을 새로운 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>50m 트리에틸람모늄 중탄산염(TEAB)의 292 μL과 리스-C(2.5단위/mL)의 8μL을 튜브에 추가합니다. 37°C에서 튜브를 3시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>튜브에 8 μg 트립신과 함께 50 mM TEAB의 100 μL을 추가합니다. 튜브를 37°C에서 12시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>튜브에 10% 트리플루오로아세산(TFA)의 25μL을 추가합니다. 4°C에서 20분 동안 튜브를 소용돌이 및 원심분리합니다.</li>
	<li>상신을 탈염을 위해 조건부 탈염 열로 옮김합니다. 진공 원심분리기 농축기를 사용하여 용황을 건조시하십시오. 참고: 메탄올 1mL로 수지 활성화, 80% 아세토닐(ACN)에서 0.1% TFA의 1mL이 뒤를 이었다. 5% ACN에서 0.1% TFA의 3mL 이상으로 유기 용매를 씻어내시다. 1.16단계에서 제조된 산성 펩티드 샘플을 적재한 다음 5% ACN에서 0.1% TFA의 3mL 이상으로 컬럼을 세척한다. 염농도가 높은 시료에 더 많은 세체가 필요할 수 있습니다. 80% ACN에서 0.1% TFA의 1mL로 인포스펩티드를 엘테.</li>
</ol>2. 탠덤 매스 태그(TMT) 라벨링
<ol><li>말린 펩티드를 200mM 4-(2-하이드록스테틸)-1-파이프라진에탄술포닉산(HEPES), pH 8.5의 100 μL로 재차질한다.</li>
	<li>각 채널(0.8 mg)의 TMT 시약을 무수액 ACN의 40 μL에서 용해하십시오. TMT 시약 튜브를 5분 동안 소용돌이쳐 아래로 회전시십시오.</li>
	<li>TMT의 40 μL을 샘플 튜브로 옮기고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 참고: 이 실험에서 채널 126 에서 128은 매니톨 처리없이 식물의 3 개의 생물학적 복제로 표지되었으며 채널 129 에서 131은 매니톨 치료를 가진 식물의 세 가지 생물학적 복제로 표지되었습니다.</li>
	<li>5% 하이드록실라민8μL을 넣고 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>5mL 튜브에 6개의 샘플을 섞고 10% TFA의 14 μL을 추가합니다.</li>
	<li>튜브에 0.1% TFA의 3,876 μL을 추가합니다. 소용돌이와 스핀 다운.</li>
	<li>솔루션을 탈염을 위해 조건부 탈염 열로 전송합니다. 증발기로 용루를 건조시다.</li>
</ol>3. IMAC 스테이지 팁 준비
<ol><li>폴리 프로필렌 프릿 디스크를 관통하는 16 G 무딘 엔드 바늘을 사용합니다. 참고: 커터를 디스크 표면에 수직으로 잡고 커터를 몇 번 굴려 디스크가 완전히 절제되었는지 확인합니다. 디스크를 페트리 접시에 담아 보관합니다. 바늘을 200 μL 파이펫 팁에 넣고 플런저를 사용하여 프릿을 팁에 밀어 넣습니다.</li>
	<li>플런저를 사용하여 프릿을 팁 끝으로 부드럽게 눌러 팁 끝을 캡합니다.<ol>
<li>더 나은 재현성을 제공하는 동일한 압력으로 팁에 frit 디스크를 배치합니다. 스테이지 팁 생산의 재현성은 원심분리기 단계의 타이밍과 기술 복제 사이의 재현성에 영향을 미치는 일정한 백압에 중요합니다.</li>
		<li>스테이지 팁이 컨디셔닝 단계에서 높은 역압을 표시하는 경우 샘플을 로드할 때 팁이 막히는 것을 방지하십시오. 디스크가 너무 단단히 제자리에 끼였을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni-NTA 스핀 컬럼을 반전시키고 1.5mL 튜브에 배치하십시오.</li>
	<li>플런저를 사용하여 Ni-NTA 구슬의 프릿을 부드럽게 누르고 구슬을 튜브에 밀어 넣습니다. 참고: 스핀 컬럼의 잠재적인 비드 손실 이나 흡착을 피하기 위해 프리를 부드럽게 밀어야 합니다.</li>
</ol>4. Hp-RP 단계 팁 준비
<ol><li>C8 디스크를 사용하여 IMAC 단계 팁에 설명된 대로 Hp-RP 단계 팁을 준비합니다. 참고: 조밀하게 포장된 frit을 초래하고 스테이지 팁의 역압이 증가할 수 있으므로 디스크에 큰 힘을 적용하지 마십시오. 모든 원심 분리 단계는 4단계에서 5분 동안 1,000 x g에서 수행됩니다.</li>
	<li>100 μL 100% 메탄올에 C18 구슬 1 mg을 일시 중단하고 팁을 통해 구슬 용액을 전달합니다.</li>
	<li>완충 8(80% ACN/20% 200mM NH4HCO2,pH 10.0)의 20 μL을 스테이지 팁에 추가하고 원심분리로 끝을 통해 버퍼 8을 통과한다.</li>
	<li>스테이지 팁에 버퍼 A(200mM NH4HCO2)의20 μL을 추가하고 원심분리로 끝을 통해 버퍼 A를 전달합니다. 참고: 사용 중 원심분리기의 균형을 맞추고 Hp-RP 단계 팁이 완전히 건조되지 않도록 합니다.</li>
</ol>5. 스핀 어댑터 준비
<ol><li>날카로운 엔드 핀셋을 사용하여 1.5mL 튜브의 뚜껑 중앙에 구멍을 뚫습니다.</li>
	<li>IMAC 스테이지 팁 또는 Hp-RP 단계 팁을 스핀 어댑터 구멍에 삽입합니다. 참고: 스테이지 팁이 스핀 어댑터 의 맨 아래에 가깝지 않은지 확인합니다.</li>
</ol>6. IMAC 단계 팁을 사용하여 인포펩티드 농축
<ol><li>10 mgNi-NTA 구슬을 400 μL로 적재 버퍼(6% 아세트산(AA), pH 3.0)로 중단하고 모든 구슬 용액을 팁당 로드합니다. 원심분리로 솔루션을 팁을 전달합니다. 참고: 모든 원심분리 단계는 6.8단계 외에 6단계에서 3분 동안 200 x g로 진행됩니다.</li>
	<li>IMAC 단계 팁에서 니켈 이온을 제거하고 원심분리에 의해 팁을 통과하기 위해 50m m 에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)의 100 μL을 적재한다.</li>
	<li>100 μL의 적재 버퍼를 단계 끝에 로드하고 원심분리로 솔루션을 통과합니다.</li>
	<li>스테이지 팁에 6% AA에 50mM FeCl3의 100 μL을 로드하고 원심분리로 팁을 통과합니다. Fe3+ 이온은 IMAC 스테이지 팁으로 킬레이트됩니다.</li>
	<li>100 μL의 적재 버퍼를 적재하여 스테이지 팁을 조건화하고 원심분리로 팁을 통해 용액을 전달합니다.</li>
	<li>단계 팁에 2.7 단계에서 준비된 시료 펩타이드와 하중 버퍼의 100 μL을 적재하고 원심분리에 의해 끝을 통해 용액을 전달한다. 참고: 새로운 튜브를 스핀 어댑터로 사용하여 시료의 흐름을 수집하고 향후 분석을 위해 동결기에서 유동을 저장합니다.</li>
	<li>세척 버퍼 100 μL(4.5% AA 및 25% ACN)을 스테이지 팁에 적재하고 원심분리로 팁을 통과합니다.</li>
	<li>로딩 버퍼로 두 번째 세척을 수행합니다. 100 μL의 적재 버퍼를 스테이지 팁에 적재하고 1000 × g 원심분리기를 사용하여 3분 동안 솔루션을 팁을 통과합니다. 참고: 세척 버퍼가 스테이지 팁의 적재 버퍼로 대체되어 용출 단계 중 인포펩티드의 손실을 제거합니다. ACN의 농도가 5% 미만인지 확인하기 위해 인포펩티드 용출 전에 IMAC 단계 팁을 평형화합니다.</li>
	<li>앞면의 IMAC 스테이지 팁을 가위로 트리밍하고 다듬어진 IMAC 스테이지 팁을 Hp-RP 팁 에 배치합니다. 스테이지 팁의 두 레이어가 원심분리기의 뚜껑을 건드리지 않도록 합니다.</li>
</ol>7. Hp-RP C18 단계 팁을 사용하여 인포펩티드 분획
<ol><li>용출 버퍼 100 μL(200mM 암모늄 인산염(NH4H2PO4)을트리밍된 IMAC 단계 팁에 추가하고 원심분리에 의해 단계 팁의 두 층을 통해 용액을 전달한다. 참고: 솔루션이 스테이지 팁을 통과하지 못하면 스핀 다운 속도를 높입니다. 모든 원심 분리 단계는 7단계에서 5분 동안 1,000 x g에서 수행됩니다. 모든 Hp-RP 버퍼는 표 1에나열됩니다.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 IMAC 스테이지 팁을 폐기하고 20 μL의 버퍼 A를 Hp-RP 단계 팁에 추가하고 원심분리로 버퍼를 통과합니다. 참고: 모든 용출 버퍼가 IMAC 단계 팁을 통과한 후 폐기해야 합니다.</li>
	<li>버퍼 1의 20 μL을 추가하여 분수 1을 elute하고 원심분리로 새 튜브에서 용출을 수집합니다. 버퍼 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 프로세스를 반복하여 새 튜브에서 각 분수를 수집합니다. 진공 농축기로 각 분획의 최종 용출을 건조시다. 참고: 신선한 분수 버퍼를 준비합니다. 각 분수의 스핀 어댑터로 8개의 새로운 튜브를 가져 가라. 다른 스핀 어댑터에서 각 분획의 용출을 수집합니다. 인포펩타이드는 기본적인 조건하에서 안정되지 않으므로 농축기또는 산성으로 용액을 즉시 10% TFA로 건조시하십시오.</li>
</ol>8. LC-MS/MS 분석 및 데이터 분석
<ol><li>0.1%의 μL을 추가하여 0.1%의 포믹산(FA)을 추가하고 질량 분광계로 샘플을 분석합니다.</li>
	<li>각 분수에 대해 6-30% 버퍼 B(80% ACN 및 0.1% FA)로 90분 그라데이션을 실행합니다.</li>
	<li>높은 충돌 에너지 해리(HCD)를 사용하여 상위 10개의 표지된 펩타이드를 단편화한다. 데이터베이스 검색을 완료하여 인산화 사이트를 식별합니다.</li>
	<li>원시 파일을 MaxQuant 소프트웨어에 로드하고, 실험이름을 지정하고, 분수 및 PTM을 설정합니다. 참고 : MaxQuant 소프트웨어의 튜토리얼은 https://www.maxquant.org/ 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>LC-MS/MS 실행 유형의 리포터 이온 MS2와 6plex TMT를 등불 라벨로 선택합니다. PIF 함수별로 필터를 활성화하고 최소 PIF를 0.75로 설정합니다.</li>
	<li>가변 변형 패널에 아세틸(단백질 N-term), 산화(M), 인(STY)을 선택한다. 카르바미도메틸(C)을 고정 수정으로 선택합니다.</li>
	<li>소화 모드를 특정로 설정하고, 트립신/P를 소화 효소로 선택하고, 두 개의 골짜기를 놓친다.</li>
	<li>PSM 거짓 발견율(FDR) 및 단백질 FDR을 0.01로 설정합니다. 수정된 펩티드에 대한 최소 점수를 40으로 설정합니다.</li>
	<li>fasta 파일 패널에 아라비도시스 탈리아나 데이터베이스를 추가하고 데이터베이스 검색을 실행합니다.</li>
	<li>검색이 완료되면 인(STY) 사이트의 txt 파일을 Perseus 소프트웨어에 로드합니다. 참고 : Perseus 소프트웨어의 자세한 튜토리얼은 https://www.maxquant.org/perseus/ 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>역형 인산화 부위를 걸로 합니다. 현지화 확률 75%를 컷오프로 사용하여 비지역화된 인산화 부위를 필터링합니다.</li>
	<li>통계 분석을 위해 인산화 부위의 강도를 사용합니다.</li>
</ol>

<ol>
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J., Azimifar, S. B., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phosphoproteomics+reveals+in+vivo+insulin+signaling+dynamics.">High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).</li><li>Bekker-Jensen, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+shotgun+strategy+for+the+rapid+generation+of+comprehensive+human+proteomes.">An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes.</a> Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).</li><li>Possemato, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+phosphoproteomic+profiling+using+titanium+dioxide+and+immunoaffinity+enrichments+reveals+complementary+phosphorylation+events.">Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events.</a> Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).</li><li>Hogrebe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+common+quantification+strategies+for+large-scale+phosphoproteomics.">Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics.</a> Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+of+Arabidopsis+Highly+ABA-Induced1+identifies+AT-Hook-Like10+phosphorylation+required+for+stress+growth+regulation.">Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).</li><li>Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=through+signaling+between+wheat+and+the+fungal+pathogen+Septoria+tritici+revealed+by+proteomics+and+phosphoproteomics.">through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics.</a> Molecular &amp; Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).</li><li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+Mass+Tag+labeling+facilitates+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+hydrophilic+phosphopeptides.">Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).</li></ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

식물 프로테오메와 인포프로테오움의 동적 범위와 복잡성은 여전히 인포프로테오믹스 분석의 깊이에 대한 제한 요소입니다. 10,000개의 인산화부위(21,22)를식별하는 단일 실행 LC-MS/MS 분석의 능력에도 불구하고, 전체 식물 인포프로테오메의 커버리지는 여전히 제한적이다. 따라서 환경 스트레스에 대응하여 식물 신호 네트워크의 글로벌 뷰를 프로파일?...

염도가 높고, 저온, 가뭄으로 인해 삼투압이 발생하며, 이는 식물 생산성1,2에영향을 미치는 주요 환경 요인이다. 단백질 인산화는 삼투압3,4,5에대한 식물 반응에서 신호 지각 및 트랜스포팅을 중재하는 가장 중요한 번역 후 변형 중 하나입니다. SNF1 관련 단백질 키나아제 2s(SnRK2s)는 삼투성 응력 신호6에관여한다. SnRK2 가족 구성원 10명 중 9명은 삼투압7,8에대한 대응으로 상당한 활성화를 보여준다. snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-12)모든 10 SnRK2에서 돌연변이를 갖는 돌연변이는 삼투압에 과민반응을 표시하였다. snrk2-dec 돌연변이체에서는, 삼투성 스트레스-유도된 이노시톨 1,4,5-트리스포산염(IP3),abscisic acid (ABA) 생합성 및 유전자 발현의 축적이 강하게 감소되어 삼투스트레스 반응6에서SnRK2s의 중요한 역할을 강조한다. 그러나, SnRK2s 키나아제는 어떻게 이 생물학 프로세스를 통제하는지 아직도 불분명합니다. 삼투압 응력에 대한 반응으로 인포프로테오믹 변화를 프로파일링하는 것은 이 격차를 해소하고 식물의 삼투압 유발 방어 메커니즘을 묘사하는 효율적인 방법입니다.
질량 분광법(MS)은 식물 인포프로테오메9를매핑하는 강력한 기술이다. 식물 인포프로테오믹스의 특성화는 식물 프로테오메의 동적 범위와 식물 리자테4의복잡성으로 인해 여전히 과제로 남아 있다. 이러한 과제를 극복하기 위해 광합성 안료 및 이차 대사 산물과 같은 원치 않는 간섭을 제거하고 식물 인포프로테오메10의깊은 커버리지를 가능하게 하는 범용 식물 인포프로테오믹 워크플로우를 개발했습니다. 고정금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 및 금속 산화물 크로마토그래피(MOC)와 같은 여러 인포펩타이드 농축 방법은 MS 분석11,12,13,14,15,16이전에인포펩티드를 농축하기 위해 개발되었다. 인스포펩티드와 함께 정화하는 산성 비인펩타이드는 인포펩티드 검출을 위한 주요 간섭이다. 이전에는 IMAC 로딩 버퍼의 pH 값 및 유기산 농도를 표준화하여 비인펩티드의 결합을 제거하고, 사전 분획단계(11)를우회하여 90% 이상의 농축 특이성을 얻었다.
인포펩티드 농축 및 분획의 다단계 공정에서 시료 손실은 인포펩티드 식별의 감도 및 인포프로테오믹 커버리지의 깊이를 저해한다. 스톱 앤 고-이동-추출 팁(무대 팁)은 팁의 끝을 캡하는 작은 디스크가 포함된 파이펫 팁으로, 펩티드 분획 및 청소17을위한 크로마토그래피와 통합할 수 있다. 단계 팁 절차 중 샘플 손실을 최소화할 수 있는 경우 튜브 간의 샘플 전달을 방지하여 최소화할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 인간 인포 프로테오메(15)의깊이를 향상 노래 인광 펩타이드에서 낮은 풍부한 다중 인광 펩티드를 분리하기 위해 Ga3 +- IMAC 및 Fe3 +-IMAC에서 단계 팁을 구현했다. 또한, 높은 pH 반전상(Hp-RP) 단계 팁의 사용은 강한 양이온 교환(SCX) 및 강력한 음이온 교환(SAX)크로마토그래피(18)에비해 인간 막 프로테오메의 폭넓은 커버리지를 입증하였다. 따라서 IMAC 및 Hp-RP 단계 팁 기술을 통합하면 단순성, 높은 특이성 및 높은 처리량으로 식물 인포프로테온 커버리지를 증가시킬 수 있습니다. 우리는 이 전략이 아라비도시스 모종에서 20,000개 이상의 인산화 부위를 확인했으며, 이는 식물 인포프로테오메19의향상된 깊이를 나타내는 것으로 입증되었다.
여기에서, 우리는 애기독증에 있는 인포프로테오믹 프로파일링을 위한 단계 팁 기지를 둔 인포프로테오믹 프로토콜을 보고합니다. 이 워크플로우는 삼투압에 대응하여 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 묘목의 인포프로테오믹 분동을 연구하기 위해 적용되었다. 인포프로테오믹 분석은 키나아제 활성화 및 초기 삼투압 신호에 연루된 인산화 부위를 밝혀냈습니다. 야생 형 및 snrk2-dec 돌연변이 인산염 데이터의 비교 분석은 높은 식물에서 osmore 응력 신호에 중요한 역할을 하는 Raf 와 같은 키나아제 (RAF)-SnRK2 키나아제 캐스케이드의 발견을 이끌어 주었습니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tube</td><td>eppendorf</td><td>22431081</td><td>Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipet tip</td><td>Gilson</td><td>F1739311</td><td></td></tr><tr><td>2-chloroacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5438080100</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>ammonium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>ammonium phosphate monbasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216003</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>blunt-ended needle</td><td>Hamilton</td><td>90516</td><td>Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16</td></tr><tr><td>C18-AQ beads</td><td>Dr. Maisch</td><td>ReproSil-Pur-C18-AQ 5 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore disk</td><td>3 M</td><td>2214</td><td>47 mm</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CX1058</td><td></td></tr><tr><td>data analysis software</td><td></td><td>Perseus 1.6.2.1</td><td>https://maxquant.net/perseus/</td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>Frits</td><td>Agilent</td><td>12131024</td><td>Frits for SPE Cartridges</td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1153334000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Iron (III) chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>mass spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ-Orbitrap Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>nano LC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Easy-nLC 1000</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA spin column</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>plunger</td><td>Hamilton</td><td>1122-01</td><td>Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 &amp;mu;l)</td></tr><tr><td>search engine software</td><td></td><td>MaxQuant 1.5.4.1</td><td>&lt;u&gt;https://www.maxquant.org&lt;/u&gt;</td></tr><tr><td>SEP-PAK Cartridge 50 mg</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td></td></tr><tr><td>sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD121P</td><td></td></tr><tr><td>TMT 6-plex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>Triethylammonium bicarbonate buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91707</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

phosphoproteomic strategy for profiling osmotic stress signaling in arabidopsis

단백질 인산화는 삼투성 조건 하에서 효소 활성 및 유전자 발현의 조절에 매우 중요합니다. 질량 분광법 (MS)기반 인포 프로 테오믹스는 식물 신호 변환을 연구하는 방법을 변화시켰습니다. 그러나, 커버리지의 깊이를 달성하기 위해 많은 시작 재료와 장기간 MS 측정 시간의 요구 사항은 식물의 글로벌 인포 프로테오믹 변화에 대한 높은 처리량 연구에 대한 제한 요인이되고있다. 식물 인산염의 감도와 처리량을 개선하기 위해, 우리는 삼투압 스트레스에 대응하여 식물 인산화 의 신속하고 포괄적 인 분석을 위한 탠덤 질량 태그 (TMT) 라벨과 결합된 정지 및 이동 추출 (stage) 팁 기반 인포프로테오믹스 접근법을 개발했습니다. 단계 팁 기술의 단순성과 높은 처리량을 활용하여 전체 절차는 두 가지 팁을 사용하여 인포펩티드 농축, 분수 및 시료 세척 단계를 완료하는 데 약 1시간이 걸리며, 이는 접근 방식의 사용하기 쉽고 높은 효율을 시사합니다. 이 접근법은 심층적인 식물 인포프로테오믹스 분석(> 11,000인스포펩티드 식별)을 제공할 뿐만 아니라 인접한 분수 간의 우수한 분리 효율(&5% 중복)을 보여줍니다. 또한, 멀티플렉싱은 TMT 라벨링을 사용하여 야생형 및 snrk2 탈취 돌연변이 식물의 인포프로테오믹 변화를 정량화하고 있다. 이 접근법은 육상 식물의 초기 삼투압 신호에 대한 이해를 밝히는 삼투압 스트레스에 대한 응답으로 Raf와 같은 키나아제의 인광 이벤트를 성공적으로 밝히는 데 사용되었습니다.

이 워크플로우의 성능을 입증하기 위해 Hp-RP 단계 팁 분획과 결합된 IMAC 단계 팁을 활용하여 30분 동안 매니톨 처리 유무에 관계없이 야생형 및 snrk2-dec 돌연변이 묘목의 인포프로테오믹 변화를 측정했습니다. 각 샘플은 생물학적 삼중방식으로 수행되었으며 실험 워크플로우가 도 1로표현된다. 각 시료의 소화된 펩티드(400 μg)는 1개의 TMT-6plex 채널로 분류되었고, 풀과 ?...

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Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

여기에 제시된 인포프로테오믹 접근법, 즉 아라비도시스 인포프로테오움의 높은 처리량과 깊은 커버리지를 제공하는 추출 팁 기반인 인포프로테오믹을 이동합니다. 이 접근은 아라비도시스에서 삼투압 신호의 개요를 설명합니다.

애기독증에서 삼투압 신호 프로파일링을 위한 인포프로테오믹 전략

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

phosphoproteomic-strategy-for-profiling-osmotic-stress-signaling

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

5.1K 조회수.  Carnegie Institute for Science. 여기에 제시된 인포프로테오믹 접근법, 즉 아라비도시스 인포프로테오움의 높은 처리량과 깊은 커버리지를 제공하는 추출 팁 기반인 인포프로테오믹을 이동합니다. 이 접근은 아라비도시스에서 삼투압 신호의 개요를 설명합니다.

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A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually determined by transcriptomic, proteomic, metabolomics and lipidomic measurements. In this protocol, we introduce a simple method for the reproducible extraction of metabolites, lipids and proteins from biological tissues using a single aliquot per sample. The extraction method is based on a methyl tert-butyl ether: methanol: water system for liquid: liquid partitioning of hydrophobic and polar metabolites into two immiscible phases along with the precipitation of proteins and other macromolecules as a solid pellet. This method, therefore, provides three different fractions of specific molecular composition, which are fully compatible with common high throughput 'omics' technologies such as liquid chromatography (LC) or gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometers. Even though the method was initially developed for the analysis of different plant tissue samples, it has proved to be fully compatible for the extraction and analysis of biological samples from systems as diverse as algae, insects, and mammalian tissues and cell cultures.

A protocol for comprehensive extraction of lipids, metabolites and proteins from biological tissues using one sample is presented.

단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

연구

생화학

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

유연한 저비용 수경 시스템 살 균 조건에서 작은 분자에 식물 응답을 평가 하기 위한

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

환경과학

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

발생학

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

애기장대에서 패턴 트리거 산화 버스트와 모종 성장 억제 어세

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

면역학 및 감염병학

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

생물학

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

식물의 셀없는 시스템에서 프로 테오 저하 시금

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. Furthermore, chloroplasts are critical for plant responses to various abiotic stresses, such as salinity and osmotic stresses. A chloroplast may contain up to ~3,000 different proteins, some of which are encoded by its own genome. However, the majority of chloroplast proteins are encoded in the nucleus and synthesized in the cytosol, and these proteins need to be imported into the chloroplast through translocons at the chloroplast envelope membranes. Recent studies have shown that the chloroplast protein import can be actively regulated by stress. To biochemically investigate such regulation of protein import under stress conditions, we developed the method described here as a quick and straightforward procedure that can easily be achieved in any laboratory. In this method, plants are grown under normal conditions and then exposed to stress conditions in liquid culture. Plant material is collected, and chloroplasts are then released by homogenization. The crude homogenate is separated by density gradient centrifugation, enabling isolation of the intact chloroplasts. Chloroplast yield is assessed by counting, and chloroplast intactness is checked under a microscope. For the protein import assays, purified chloroplasts are incubated with 35S radiolabeled in vitro translated precursor proteins, and time-course experiments are conducted to enable comparisons of import rates between genotypes under stress conditions. We present data generated using this method which show that the rate of protein import into chloroplasts from a regulatory mutant is specifically altered under osmotic stress conditions.

Here we describe a new method to study protein import into isolated chloroplasts under stress. The method is rapid and straightforward, and can be applied to study the consequences of different stress conditions for chloroplast protein import, and the corresponding regulatory mechanisms.

스트레스 식물에서 분리 된 엽록체로 단백질 가져 오기의 분석

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant productivity and survival. As such, understanding the mechanisms by which stomata develop and pattern has tremendous agronomic value. This paper describes two phenotypic methods using Arabidopsis cotyledons that can be used to characterize the genes controlling stomatal development and patterning. Presented first are procedures for analyzing the stomatal phenotypes using toluidine blue O-stained cotyledons. This method is fast and reliable and does not require the use of epidermal peels, which are widely used for phenotypic analyses but require specialized training. Due to the presence of multiple cysteine residues, the identification and generation of bioactive EPF peptides that have a role in stomatal development have been challenging. Thus, presented second is a procedure used to identify stomatal ligands and monitor their biological activity by bioassays. The main advantage of this method is that it produces reproducible data relatively easily while reducing the amount of peptide solution and the time required to characterize the role of the peptides in controlling stomatal patterning and development. Overall, these well-designed protocols enhance the efficiency of studying the potential stomatal regulators, including cysteine-rich secretory peptides, which require highly complex structures for their activity.

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

This paper describes two phenotyping methods without the use of epidermal peels to characterize the genes controlling stomatal development. The first method demonstrates how to analyze a stomatal phenotype using a toluidine blue O-stained plant epidermis. The second method describes how to identify stomatal ligands and monitor their biological activities.

표피 표현형 점수를 통한 기공 발달에 관여하는 유전자 식별

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

기후 관련 스트레스에 따른 감자 복원력 분석

High Throughput Image-Based Phenotyping for Determining Morphological and Physiological Responses to Single and Combined Stresses in Potato

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions over time. By using multiple imaging sensors, many traits of interest can be assessed, including plant biomass, photosynthetic efficiency, canopy temperature, and leaf reflectance indices. Plants are frequently exposed to multiple stresses under field conditions where severe heat waves, flooding, and drought events seriously threaten crop productivity. When stresses coincide, resulting effects on plants can be distinct due to synergistic or antagonistic interactions. To elucidate how potato plants respond to single and combined stresses that resemble naturally occurring stress scenarios, five different treatments were imposed on a selected potato cultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) at the onset of tuberization, i.e. control, drought, heat, waterlogging, and combinations of heat, drought, and waterlogging stresses. Our analysis shows that waterlogging stress had the most detrimental effect on plant performance, leading to fast and drastic physiological responses related to stomatal closure, including a reduction in the quantum yield and efficiency of photosystem II and an increase in canopy temperature and water index. Under heat and combined stress treatments, the relative growth rate was reduced in the early phase of stress. Under drought and combined stresses, plant volume and photosynthetic performance dropped with an increased temperature and stomata closure in the late phase of stress. The combination of optimized stress treatment under defined environmental conditions together with selected phenotyping protocols allowed to reveal&#160;the dynamics of morphological and physiological responses to single and combined stresses. Here, a useful tool is presented for plant researchers looking to identify plant traits indicative of resilience to several climate change-related stresses.

저자 스포트라이트: PlantScreen 로봇 플랫폼을 사용하여 비생물적 스트레스에 대한 식물의 반응 규명

We designed an image-based phenotyping protocol to determine the morphological and physiological responses to single and combined heat, drought, and waterlogging treatments. This approach enabled the identification of early, late, and recovery responses at a whole plant level, particularly above-ground parts, and highlighted the necessity of using multiple imaging sensors.

감자의 단일 및 결합 스트레스에 대한 형태학적 및 생리학적 반응을 결정하기 위한 고처리량 이미지 기반 표현형 분석

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions ...