이 프로젝트는 KWF-STW (어린 시절 확산 본질적인 Pontine 신경교종 및 고급 신경교종에서 소노포레이션에 의한 약물 전달)에 의해 투자되었습니다. 우리는 일리아 스카흐코프와 찰스 무게노가 시스템 개발에 대한 그들의 의견에 감사드립니다.

모든 생체 내 실험은 네덜란드 윤리위원회(면허 허가 번호 AVD11400202017841)와 네덜란드 브리제 유니버사이트트 암스테르담의 동물 복지 기구에 의해 승인되었습니다. 조사관은 동물의 불편함을 최소화하기 위해 FUS 시스템의 기본 교육을 받았습니다.
1. 집중 초음파 시스템
참고: 설명된 설정은 시판 되는 구성 요소를 기반으로 한 내부 구축 된 BBB 중단 시스템이며 3D 인쇄 된 사용자 정의 콘 및 분리 가능한 입체 플랫폼을 포함합니다. 이 시스템은 모듈식으로 설계되어 사용 가능한 장비 및 특정 용도에 따라 수정을 용이하게 합니다. 프로토콜은 마우스 두뇌의 pontine 지구에 있는 더 큰 지역의 sonoporing를 위한 절차를 설명합니다. 대상 위치를 조정 하 여, 뇌의 다른 부분을 대상으로 수 있습니다. 이 연구에서는 초점 길이75mm의 1MHz 모노 엘리먼트 트랜스듀서, 60mm의 조리개와 1.5 x 1.5 x 5mm(피크 압력의 FWHM)의 초점 영역이 사용되었습니다. 트랜스듀서의 초점 평면은 귀 막대와 교차하는 수평 평면에서 동물의 두개골을 통해 배치됩니다.
<ol><li>설치류에서 BBB 개구부에 적합한 트랜스듀서를 선택합니다. 참고: 마이크로버블 및 고용된 주파수의 특성에 따라 음향 설정, 특히 기계지수(MI)는13,38로변경될 수 있다.</li>
	<li>트랜스듀서를 3D 프린팅 원뿔에 놓습니다.</li>
	<li>원뿔의 하단에 음향적으로 투명한 마일라 멤브레인을 사용하여 빔 전파 경로의 음향 결합을 달성하고 원뿔을 탈기물로 채웁니다.</li>
	<li>도 1에 도시된 바와 같이 전동 선형 스테이지에서 동물 위에 트랜스듀서를 장착하여 트랜스듀서의 자동 수직 위치를 허용합니다.</li>
	<li>도 1 및 도 2에도시된 바와 같이 온도 조절 가열, 물린 및 귀 바, 마취 및 다중 양식 유도 마커를 포함하는 연구의 요구 사항에 따라 분리 가능한 스테레오테틱 플랫폼을 설계한다. 스테레오전술 플랫폼의 장착은 2D 선형 스테이지 시스템으로 구성되어 있으며, 빔 아래 동물의 정확한 자동 포지셔닝(< 0.1mm)을 허용합니다.</li>
	<li>트랜스듀서, 기능 발생기 및 파워 앰프로 구성된 도 1에 표시된 음향 방출 체인에 트랜스듀서를 연결합니다.</li>
	<li>이미지 처리 파이프라인을 고안하여 바늘 하이드로폰에 의해 검출된 캐비테이션 데이터의 관심 영역과 수집의 두뇌 영역의 정확한 소포화 타겟팅을 허용하는 다중 양식 유도 마커를 검출한다.</li>
	<li>시스템을 보정하고 스테레오테전술 플랫폼에서 동물의 수직 위치에 대응하여 트랜스듀서의 초점 점을 결정합니다.</li>
</ol>2. 동물 준비
참고: 다음 프로토콜은 마우스에 대해 지정되지만 쥐에 맞게 조정할 수 있습니다. 이러한 실험을 위해 암컷 자티믹 누드 Foxn1-- 마우스(6-8주)가 사용되었다.
<ol><li>동물이 동물 시설에서 적어도 일주일 동안 적응하고 정기적으로 동물의 무게를 허용합니다.</li>
	<li>부프레노르핀(0.05 mg/kg)을 피하(s.c.) 주사를 통해 FUS 치료 30분 전에 진통 치료를 시작한다.</li>
	<li>동물을 3% 이소플루란, 2 L/min O2로 마취시키고 동물이 심히 마취되었는지 확인합니다. 전체 절차 동안 마취 된 동물을 유지하고 필요에 따라 이소플루란의 농도를 조정하기 위해 호흡 빈도와 심박수를 모니터링하십시오.</li>
	<li>안구 건조증을 방지하고 가능한 부상을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.</li>
	<li>면도기와 탈필 크림으로 머리 위에 있는 머리카락을 제거하고 물로 씻어 피부에 자극을 피하기 위해 잔류물을 제거합니다.</li>
	<li>BLI 종양 모델을 실험하기 위해 BLI 이미지 지도를 위한 29 G 인슐린 주사기와 함께 D-루시페린(30 mg/mL) 내역(i.p.)의 150 μL을 주입한다.</li>
	<li>26-30 G 꼬리 정맥 카테터를 삽입하고 소량의 헤파린 용액 (5 UI / mL)으로 카테터와 정맥을 플러시하십시오. 혈연을 피하기 위해 헤파린 용액으로 카테터를 채웁니다. 참고 : 카테터에 혈액의 역류가있을 때 좋은 카테터 삽입이 보입니다. 색전을 방지하기 위해 카테터의 기포를 피하십시오. 과도한 사출 압력을 피하려면 카테터의 길이가 가능한 한 짧는지 확인하십시오.</li>
	<li>저체온증을 피하기 위해 온도 조절 된 입체 플랫폼에 동물을 놓습니다. 참고: 저체온증은 혈액 순환을 감소시켜, 이는 마이크로 버블의 주사/순환과 약물의약동학(39)에영향을 미칠 수 있다.</li>
	<li>이어 바와 바이트 바를 사용하여 고정 및 고정 플랫폼에서 동물의 머리를 고정하고 고정합니다. 스트랩으로 몸을 고정하고 동물의 꼬리를 플랫폼에 테이프로 붙입니다.</li>
</ol>3. 생체 내 이미지 유도 중심 초음파
참고: 이 프로토콜의 경우 10ms 지속 시간이 있는 톤 버스트 펄스가 있는 1MHz 모노 엘리먼트 트랜스듀서, 0.4의 MI 및 240s에 대해 40사이클이 있는 1.6Hz의 펄스 반복 주파수가 사용되었습니다. 이 프로토콜은 무해한 가스로서 유황 헥사플루오라이드(SF6)를함유한 인지질에 의해 안정화된 마이크로버블에 최적화되어 있으며, 이에 따라 평균 기포 직경은 2.5 μm이고 기포의 90% 이상이 8 μm보다 작다.
<ol><li>이미징 양식(예:BLI 또는 X선)에 장착된 동물과 함께 스테레오전술 플랫폼을 배치하고 동물의 이미지를 촬영합니다.</li>
	<li>이미지 처리 파이프라인과 함께 다중 양식 서두마커를 사용하여 트랜스듀서의 초점 지점에 따라 동물의 위치를 표시합니다.</li>
	<li>획득한 X선 영상 위에 뇌 윤곽을 배치하거나 BLI 영상을 사용하여 종양의 중심을 결정함으로써 표적 영역을 결정한다(도2). 뇌의 특정 부분의 위치는 참조 점으로 두개골 표시 bregma와 람다를 사용하여 Paxinos 뇌 아틀라스40에 지정됩니다. 예를 들어 폰은 람다에서 x=-1.0, y=-0.8 및 z=-4.5에 있습니다.</li>
	<li>초음파 젤이 호흡을 방해하는 것을 방지하기 위해 동물의 콧구멍과 입을 접착제 테이프로 보호합니다.</li>
	<li>동물의 머리 위에 초음파 젤을 바르세요.</li>
	<li>동물의 목의 피부를 철회하고, 초음파 젤로 바늘 수압을 윤활하고, 후두 뼈의 바로 근처에 바늘 수중전화를 놓습니다.</li>
	<li>이미지 처리 파이프라인과 포커스 포인트를 사용하여 트랜스듀서를 올바른 위치로 안내합니다.</li>
	<li>미리 구성된 설정을 연결된 모든 장치에 적용하고 관심 있는 뇌 영역을 타겟팅합니다. 참고: 연구 질문에 따라 종양 또는 뇌 영역은 도 2에도시된 바와 같이 단일 초점 또는 체적 모양으로 포포화될 수 있다.</li>
	<li>제조업체에서 설명한 대로 마이크로 버블을 활성화합니다. 마이크로 버블 120 μL (5.4 μg)의 볼러스 하나를 주입합니다.</li>
	<li>카테터의 개구부를 확인하기 위해 식염수로 꼬리 정맥 카테터를 플러시하십시오.</li>
	<li>마이크로 버블을 주입하고 소네이션을 시작합니다.</li>
	<li>바늘 하이드로폰으로 마이크로 버블 캐비테이션을 기록합니다.</li>
	<li>소포화 후 내항제 또는 약물을 투여한다. 복용량, 타이밍 및 계획 연구 와 약물의 목적에 따라 달라 집니다. 참고: 에반스 블루는 BBB 오프닝41을평가하는 일반적인 색상 에이전트입니다.</li>
	<li>미리 정해진 시점 또는 인도적 끝점 앞까지 동물을 모니터링합니다.</li>
</ol>4. 마이크로 버블 캐비테이션 분석
참고: 여기에 적용 된 절차는 원래 McDannold et alal al 12에의해 제안 된 바와 같이, 1MHz의 주파수에서 10 ms 지속시간의 버스트 톤 펄스로 흥분 2.5 μm (8 μm 아래 기포의 80 %)의 평균 직경2.5 μm (8 μm 이하의 기포의 80 %)에 대한 생체 내 실험에 적합하다.
<ol><li>Fourier는 시간 도메인에서 기록된 PCD 신호를 주파수 도메인으로 변환합니다.</li>
	<li>그림 3(2MHz 및 3MHz의 녹색 상자)에 도시된 바와 같이2nd 및3rd 고조파(± 50kHz) 주변의 안정적인 캐비테이션 감지를 위한 결과 스펙트럼 전력을 통합합니다.</li>
	<li>도 3(빨간 상자)에 도시된 바와 같이 주 주파수,2nd,3rd 고조파,1st 및2nd 초하모닉 및 첫 번째 서브 고조파(± 150kHz) 사이에 관성 캐비테이션 검출을 위한 스펙트럼 전력을 통합한다.</li>
	<li>이전에 획득한 PCD 신호의 정규화를 위해 원리 주파수(1MHz ± 50kHz)를 중심으로 스펙트럼 전력을 통합합니다. 참고: PCD 신호는 1MHz에서 생체 내 의 SF6-인지질마이크로 버블에 대해, 도 3에도시된 바와 같이 관성 캐비테이션 이에 설정되기 전에 초하모닉 또는 하모니를 표시하지 않는다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 연구에서는, 우리는 뇌 parenchyma로 증가한 약 납품을 위한 일시적인 BBB 중단을 위한 비용 효과적인 이미지 유도한 기지를 둔 FUS 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 주로 시판되는 구성 요소와 X 선 및 BLI와 함께 제작되었습니다. 제안된 설계의 모듈화를 통해 고처리량 워크플로우에서 계획 및 평가를 위한 여러 이미징 모듈을 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 고해상도 MRI 또는 마이크로 CT와 ?...

혈액 뇌 장벽 (BBB)은 뇌 빈혈종으로 약물 전달의 주요 장애물입니다. 개발된 대부분의 치료약물은 그들의 물리화학적 파라미터(예를 들어, 리포필리시티, 분자량, 수소결합 수용자 및 기증자)로 인해 BBB를 교차하지 않거나뇌의efflux 수송자에 대한 친화력으로 인해 유지되지 않는다1,2. BBB를 교차할 수 있는 약물의 작은 단은 전형적으로 작은 리포필성 분자입니다, 이는 뇌 질환의 제한된 수에만 효과적이다1,2. 그 결과, 대부분의 뇌질환에 대해 약리학적 치료 옵션이 제한되어 있으며 신약 전달 전략이3,4가필요하다.
치료 초음파는 BBB 중단 (BBBD), 신경 변조 및 절제4,5,6,7과같은 다른 신경 학적 응용 프로그램에 사용할 수있는 새로운 기술이다. 두개골을 통해 초대형 초음파 방출기로 BBB 개구부를 달성하기 위해, 집중 초음파 (FUS)는 마이크로 버블과 결합된다. 마이크로버블 매개 FUS는 뇌 의 parenchyma5,8,9에서약물의 생체 이용률을 증가시합니다. 음파가 존재하여, 마이크로 버블은 BBB의 내피 세포 사이의 단단한 접합의 트랜시토시스 및 중단을 개시하기 시작하여 더 큰분자(10)의초세포 수송을 가능하게 한다. 이전 연구는 음향 방출의 강도와 BBB개방11,12,13,14에대한 생물학적 영향 사이의 상관 관계를 확인했습니다. FUS는 이미 화학요법제제로서 테모졸로미드 또는 리포소말 독소루비신을 이용한 교모세포종의 치료를 위한 임상시험에서 사용되거나, 알츠하이머병 및 근위축성 측삭 경화증5,9,15,16의치료에 사용되고있다.
초음파 매개 BBB 개방은 약학에 대한 완전히 새로운 가능성에서 결과, 임상 번역을위한 전임상 연구가 선택 된 약물 후보의 치료 반응을 평가하는 데 필요합니다. 이를 위해서는 일반적으로 고공간 정밀도와 높은 재현성을 가진 표적 BBB 개구부를 모니터링하기 위한 통합 캐비테이션 감지가 모두 필요한 고처리량 워크플로우가 필요합니다. 가능하면 이러한 시스템은 연구 규모에 따라 확장 가능하기 위해 초기 투자 및 운영 비용 모두에서 비용 효율적이어야 합니다. 대부분의 전임상 FUS 시스템은 이미지 지도 및 치료 계획을 위한 MRI와 결합되어15,17,18,19. MRI는 종양 해부학 및 부피에 대한 자세한 정보를 제공하지만, 일반적으로 훈련 / 숙련 된 연산자가 수행하는 비싼 기술입니다. 또한, 고해상도 MRI는 전임상 시설에서 연구원을 위해 항상 유효하지 않을 수 있고 동물 당 긴 주사 시간을 필요로 합니다, 고처리량 약리학 연구 결과에 적게 적합합니다. 주목할 만한 점은, 신경 종양학 분야의 전임상 연구, 특히 침투종양 모델의 경우 종양을 시각화하고 표적으로 하는 가능성이 치료성공(20)에필수적이라는 점입니다. 현재, 이 요구 사항은 단지 MRI 또는 광단백질로 유도된 종양에 의해서만 성취되고, 광단백질 기판의 투여와 함께 생물 발광 화상 진찰(BLI)을 가진 시각화를 가능하게 합니다.
MRI 유도 FUS 시스템은 종종 수조를 사용하여 두개골 응용 프로그램에 대한 초음파 파 전파를 보장하며, 동물의 머리가 부분적으로 물에 잠겨 소위 '상향식'시스템(15,17,18)을사용합니다. 이러한 디자인은 일반적으로 작은 동물 연구에서 잘 작동 하지만, 그들은 동물 준비 시간 사이 타협, 휴대성 및 사용 하는 동안 현실적으로 유지 보수 위생 기준. MRI에 대한 대안으로, 스테레오테테네비게이션을 위한 다른 안내 방법은 설치류 해부학 아틀라스21,22,23,레이저 포인터 보조 시각 시력 24, 핀홀 보조 기계 스캐닝장치(25)또는 BLI26의사용을 포함한다. 이러한 디자인의 대부분은 트랜스듀서가 동물의 머리 위에 놓여있는 "하향식"시스템으로 동물이 자연적인 위치에 있습니다. '하향식' 워크플로우는수조 22,25,26 또는 물로 채워진 콘21,24로구성됩니다. 닫힌 콘 내부에 트랜스듀서를 사용하는 이점은 전체 워크플로우를 단순화하는 보다 컴팩트한 설치 공간, 짧은 설치 시간 및 직선 제거 가능성입니다.
마이크로 버블과 음향 필드의 상호 작용은 압력에 의존하며 저진폭 진동 (안정 캐비테이션이라고 함)에서 과도 기포 붕괴 (관성 캐비테이션이라고 함)27,28에이르기까지 다양합니다. 초음파-BBBD는 성공적인 BBBD를 달성하기 위해 안정적인 캐비테이션 임계값보다 훨씬 높은 음향 압력이 필요하다는 확고한 합의가 있지만 일반적으로 혈관/신경손상(29)과연관되는 관성 캐비테이션 임계값 미만이다. 가장 일반적인 모니터링 및 제어 형태는 McDannold 외12에서제안한 수동 캐비테이션 검출(PCD)을 사용하여 (백)산란된 음향 신호의 분석이다. PCD는 안정적인 캐비테이션 특징(고조파, 하모니, 초하모닉) 및 관성 캐비테이션 마커(광대역 응답)의 강도와 외관이 실시간으로 측정될 수 있는 마이크로 버블 방출 신호의 Fourier 스펙트럼 분석에 의존한다.
정밀압력제어를 위한 PCD 분석은 마이크로버블 제형의 다각성(진동 진폭은 버블 직경에 강하게 의존), 브랜드 간 버블 쉘 특성의 차이, 주파수 및압력(30,31,32)에크게 의존하는 음향 진동으로 인해 복잡하다. 그 결과, 이러한 모든 매개 변수의 특정 조합에 적응하고 다양한 응용 시나리오(작은 동물 프로토콜을 통해 시험관 내 실험에서 임상 사용을 위한 PCD에 이르기까지)에 사용되어 왔으며, 강력한 캐비테이션검출을 위해, 심지어 압력11,14,30,31, 31, 32,33, 33, 33의소급 피드백 제어를 위해 다양한 응용 시나리오에 사용되어왔다. 본 연구의 범위에 사용되는 PCD 프로토콜은 McDannold 외12에서 직접 파생되며 관성 캐비테이션 검출을 위한 안정적인 캐비테이션 및 광대역 소음의 존재를 모니터링합니다.
우리는 뇌 완두엽종으로 약물 전달을 증가시키기 위해 BBB의 일시적인 개방을위한 이미지 유도 신경 탐색 FUS 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 시판되는 구성 요소를 기반으로 하며 동물 시설에서 사용 가능한 이미징 기술에 따라 여러 가지 이미징 양식에 쉽게 적응할 수 있습니다. 높은 처리량 워크플로우가 필요하기 때문에 이미지 지도 및 치료 계획에 X선 및 BLI를 사용하기로 결정했습니다. 광단백질(예를 들어, 루시파아제)으로 유도된 종양 세포는 BLI이미징(20)에적합하다. 광단백질 기판의 투여 후, 종양 세포는 생체 내에서 모니터링될 수 있고 종양 성장 및 위치는20,36으로결정될 수 있다. BLI는 저비용 이미징 양상이며, 시간이 지남에 따라 종양 성장을 따를 수 있으며, 빠른 스캔 시간을 가지며 MRI36,37로측정된 종양 성장과 잘 연관된다. 우리는 설치류가 장착되는 플랫폼을 자유롭게 움직일 수 있도록 트랜스듀서에 부착된 수조를 수조로 교체하기로 결정했습니다8,24. 이 디자인은 (I) 소형 동물 스테레오테틱 플랫폼(II) 선및 광학 이미지 호환성(III) 급속 분리식 마취 마스크및 (IV) 통합 온도 조절 동물 가열 시스템을 모두 갖춘 분리형 플랫폼을 기반으로 합니다. 마취의 초기 유도 후, 동물은 전체 절차 동안 남아있는 플랫폼에 정확한 위치에 장착됩니다. 따라서 전체 플랫폼은 정확하고 재현 가능한 위치와 지속적인 마취를 유지하면서 전체 개입 워크플로우의 모든 스테이션을 전달합니다. 제어 소프트웨어는 fiducial 마커의 자동 감지를 허용하고 자동으로 이미지 및 이미지 양식의 모든 유형을 등록 (즉, 마이크로 CT, X 선, BLI 및 형광 이미징) 스테레오테틱 플랫폼의 참조 프레임에. 자동 교정 절차의 도움으로 초음파 트랜스듀서의 초점 거리는 개입 계획, 음향 전달 및 후속 이미징 분석의 자동 융합을 가능하게하는 내부에서 정확하게 알려져 있습니다. 도 1 및 도 2와같이 이 설정은 전용 실험 워크플로우를 설계하는 데 높은 수준의 유연성을 제공하며 다양한 스테이션에서 동물의 상호 처리가 가능하므로 높은 처리량 실험을 용이하게 합니다. 우리는 확산 중간 선 신경종과 같은 고급 신경교종의 마우스 xenografts에서 성공적인 약물 전달을 위해이 기술을 사용했습니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL luer-lock syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td>Plastipak</td></tr><tr><td>19 G needle</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN1938R1</td><td></td></tr><tr><td>23 G needle</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN2316R1</td><td></td></tr><tr><td>3M Transpore surgical tape</td><td>Science applied to life</td><td>7000032707</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Arbitrary waveform generator</td><td>Siglent</td><td>n.a.</td><td>SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s</td></tr><tr><td>Automated stereotact</td><td>in-house built</td><td>n.a.</td><td>Stereotact with all elements were in-house built</td></tr><tr><td>Bruker In-Vivo Xtreme</td><td>Bruker</td><td>n.a.</td><td>Includes software</td></tr><tr><td>Buffered NaCl solution</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine hydrochloride</td><td>Indivior UK limitd</td><td>n.a.</td><td>0.324 mg</td></tr><tr><td>Cage enrichment: paper-pulp smart home</td><td>Bio services</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Carbon filter</td><td>Bickford</td><td>NC0111395</td><td>Omnicon f/air</td></tr><tr><td>Ceramic spoon</td><td>n.a</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin, potassium salt</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VUmc pharmacy</td><td>n.a.</td><td>70%</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Fresenius NaCl 0.9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.</td><td>NaCl 0.9 %, 1000 mL</td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun Surgical</td><td>n.a.</td><td>Histoacryl 0.5 mL</td></tr><tr><td>Hydrophone</td><td>Precision Acoustics</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>324825/324826</td><td>0.5 mL and 0.3 mL</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>TEVA Pharmachemie BV</td><td>8711218013196</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Alfasan</td><td>n.a.</td><td>10 %, 10 mL</td></tr><tr><td>Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet</td><td>Envigo</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Neoflon catheter</td><td>Becton Dickinson</td><td>391349</td><td>26 GA 0.6 x 19 mm</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Keysight technologies</td><td>n.a.</td><td>InfiniiVision DSOX024A</td></tr><tr><td>Plastic tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Power amplifier</td><td>Electronics &amp;amp; Innovation Ltd</td><td>210L</td><td>Model 210L</td></tr><tr><td>Preamplifier DC Coupler</td><td>Precision Acoustics</td><td>n..</td><td>Serial number: DCPS94</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Sedazine</td><td>AST Farma</td><td>n.a.</td><td>2%</td></tr><tr><td>SonoVue microbubbles</td><td>Bracco</td><td>n.a.</td><td>8 &amp;micro;l/ml</td></tr><tr><td>Sterile water</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.</td><td>1000 mL</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>various syringes can be used</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Indivior UK limitd</td><td>n.a.</td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>Transducer</td><td>Precision Acoustics</td><td>n.a.</td><td>1 MHz</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Ultrasound gel</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>01-02</td><td>Aquasonic 100</td></tr><tr><td>Vidisic gel</td><td>Bausch + Lomb</td><td>n.a.</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

a high-throughput image-guided stereotactic neuronavigation and focused ultrasound system for blood-brain barrier opening in rodents

혈액-뇌 장벽 (BBB) 다양 한 뇌 질환의 치료에 대 한 주요 장애물 되었습니다. 좁은 접합에 의해 연결된 내피 세포는 큰 분자 (>500 Da)가 뇌 조직에 진입하는 것을 방지하는 생리적 장벽을 형성합니다. 마이크로 버블 매개 집중 초음파 (FUS)는 과도 한 로컬 BBB 개방을 유도하는 데 사용할 수 있습니다, 더 큰 약물이 뇌 parenchyma입력 할 수 있도록.
임상 번역을 위한 대규모 임상 장치 이외에, 약 후보의 치료 반응 평가를 위한 전임상 연구는 표적으로 한 BBB 개방을 위한 전용된 작은 동물 초음파 설치를 요구합니다. 바람직하게는 이러한 시스템은 고공간 정밀도와 통합 캐비테이션 모니터링을 모두 갖춘 고처리량 워크플로우를 허용하면서도 초기 투자및 운영 비용 모두에서 비용 효율적입니다.
여기서는 시판되는 부품을 기반으로 하고 전술한 요구 사항을 충족하는 생물 발광 및 X선 유도 스테레오전술 소형 동물 FUS 시스템을 소개합니다. 특히 높은 수준의 자동화로 인해 일반적으로 대량의 전임상 약물 평가 연구에서 발생하는 과제를 용이하게 합니다. 이러한 과제의 예로는 데이터 재현성을 보장하고, 그룹 내 가변성을 줄이며, 샘플 크기를 줄이며, 윤리적 요구 사항을 준수하고 불필요한 워크로드를 줄이기 위해 표준화가 필요합니다. 제안된 BBB 시스템은 교모세포종 다중포메 및 확산 미드라인 신경교종의 환자 유래 xenograft 모델에 대한 BBB 개방 촉진 약물 전달 예심의 범위에서 검증되었습니다.

설명된 FUS시스템(도 1 및 도 2)및 관련 워크플로우가 100마리 이상의 동물에서 사용되었으며 건강한 마우스와 종양 베어링 마우스 모두에 대한 재현 가능한 데이터를 생성하였다. 마이크로버블 볼루스 주입의 피크 순간에 고조파에서 기록된 캐비테이션 및 스펙트럼 밀도에 기초하여, 각 주파수의 스펙트럼 전력은 프로토콜의 4단계에서 설명된 바와 같?...

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A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

혈액-뇌 장벽 (BBB) 일시적으로 마이크로 버블 매개 집중 초음파로 중단 될 수 있습니다 (FUS). 여기서는 비초음파 전문가가 액세스할 수 있는 모듈식 FUS 시스템을 사용하여 생체 내 고처리량 BBB 개방을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

설치류의 혈액 뇌 장벽 개방을 위한 고처리량 이미지 유도 입체 신경 탐색 및 집중 초음파 시스템

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

a-high-throughput-image-guided-stereotactic-neuronavigation-focused

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.7K 조회수.  Cancer Center Amsterdam. 혈액-뇌 장벽 (BBB) 일시적으로 마이크로 버블 매개 집중 초음파로 중단 될 수 있습니다 (FUS). 여기서는 비초음파 전문가가 액세스할 수 있는 모듈식 FUS 시스템을 사용하여 생체 내 고처리량 BBB 개방을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

비디오: A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

쥐 모델에서 Transcranial 집중 초음파를 사용하여 혈액 - 뇌 장벽의 MRI를 유도 장애

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

연구

의학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

신경과학

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

여러인지 기능을 테스트 및 설치류에의 연결 활동을 녹음하기위한 완전 자동화된 고도 다목적 시스템

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

뇌 조각에서 뉴런 연구를위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중된 초음파 및 마이크로 버블 치료를 시각화하는 실시간 인트라바이탈 다광원 현미경 검사법

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

생체공학

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

쥐 모델에서 집중 초음파를 사용하여 위치 특정 혈액 뇌 장벽 개방에 대한 벤치 탑 접근

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

뇌 구조를 표적으로 삼고 화학 유전 학적 신경 조절을 평가하기위한 집중 초음파 유도 혈액 뇌 장벽 개방

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Enhancing Drug Delivery to the Brain: MRI-Guided Ultrasound Techniques in Rats

Monitoring Blood-Brain Barrier Opening in Rats with a Preclinical Focused Ultrasound System

The brain has a highly selective semipermeable blood barrier, termed the blood-brain barrier (BBB), which prevents the delivery of therapeutic macromolecular agents to the brain. The integration of MR-guided low-intensity pulsed focused ultrasound (FUS) with microbubble pre-injection is a promising technique for non-invasive and non-toxic BBB modulation. MRI can offer superior soft-tissue contrast and various quantitative assessments, such as vascular permeability, perfusion, and the spatial-temporal distribution of MRI contrast agents. Notably, contrast-enhanced MRI techniques with gadolinium-based MR contrast agents have been shown to be the gold standard for detecting BBB openings. This study outlines a comprehensive methodology involving MRI protocols and animal procedures for monitoring BBB opening in a rat model. The rat model provides the added benefit of jugular vein catheter utilization, which facilitates rapid medication administration. A stereotactic-guided preclinical FUS transducer facilitates the refinement and streamlining of animal procedures and MRI protocols. The resulting methods are characterized by reproducibility and simplicity, eliminating the need for specialized surgical expertise. This research endeavors to contribute to the optimization of preclinical procedures with rat models and encourage further investigation into the modulation of the BBB to enhance therapeutic interventions in neurological disorders.

This study describes a combined magnetic resonance imaging (MRI) and low-intensity pulsed focused ultrasound (FUS) protocol, utilizing living rats with jugular vein catheterization to monitor blood-brain barrier (BBB) opening.

The brain has a highly selective semipermeable blood barrier, termed the blood-brain barrier (BBB), which prevents the delivery of therapeutic ...

Focus Ultrasound Based Microbubble Mediated Blood-Brain Barrier Opening: A Technique to Create Localized Transient Openings in Blood-Brain Barrier of Mouse by Sonoporation

Source: Haumann, R. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/61269" target="_blank">A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes a method of temporarily disrupting the blood-brain barrier (BBB) by creating transient openings using microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). These transient local BBB openings can eventually be used to deliver larger-sized drug molecules directly into the brain parenchyma.

Focus Ultrasound based microbubble mediated Blood-Brain Barrier Opening: A technique to create localized transient openings in mouse by sosoporation(초음파 기반 마이크로버블 매개 혈액-뇌 장벽 개구부: 초음파 처리에 의한 마우스의 혈액-뇌 장벽에 국부적인 일시적인 개구부를 생성하는 기술)

Source: Haumann, R. et al. A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in ...