이 연구는 MRC 박사 훈련 파트너십 (MR /K501293/1), 영국 재생 의학 플랫폼 (MRC MR /L022974/1 및 MR/K02666/1), 수석 과학자 사무소 (TCS/16/37)의 수상으로 지원되었습니다.

1. 라미닌-521에 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC) 유지 보수
<ol><li>인간 다능성 세포(hPSC)를 라미닌-521(LN-521)에 6웰 플레이트에서 37°C 및 5%CO2로 유지한다. 줄기세포 유지보수 배지(즉, mTeSR1 배지)의 2mL로 매일 세포를 공급하여 6웰 플레이트당 분화를 위해 선택한 종자일(일 0)까지 공급한다.</li>
	<li>세포 수확 전에 70-80%의 원하는 세포 합류가 달성되는지 확인하십시오.</li>
</ol>2. 라민-521 멀티웰 준비 및 차별화를 위한 hPSC 시드
참고: HPSC의 경우 LN-521(예를 들어, 마트리겔 또는 섬유네틴)에 유지되지 않는 hPSC를 LN-521및 문화로 분할하여 1주 동안 의공정의효율을 향상시키기 위해 월화 및 분화를 유도한다15,17,18.
<ol><li>라미닌 코팅 플레이트 준비<ol>
<li>재조합 LN-521(100 μg/mL)의 바이알을 4°C에서 2시간 또는 하룻밤 동안 해동한다.</li>
		<li>Ca2+/Mg2 +얼음 차가운 1x DPBS에서 해동 된 LN-521을 희석하여 8 μg / mL 솔루션을 준비하십시오.</li>
		<li>8 μg/mL LN-521 용액의 0.25mL을 24웰 플레이트 또는 0.05 mL의 각 웰에 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. LN-521 용액으로 접시를 좌우로 부드럽게 흔들어 우물을 고르게 코팅합니다. 참고: 96웰 플레이트 형식의 경우, 반자동 파이프라인을 사용하여 볼륨 디스펜싱, 셀 파싱 및 중간 변화를 수행할 수 있습니다. 자세한 내용은 메세게르 리폴스 외19를참조하십시오.</li>
		<li>LN-521 코팅 플레이트를 반투명하고 유연한 필름으로 밀봉하고 사용하기 전에 밤새 4 °C에 보관하십시오. 참고: LN-521 코팅 플레이트는 4°C에 보관할 때 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. 라미닌 코팅 된 우물의 건조를 피하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 파종 당일, 30-60분 동안 37°C에서 세포 배양 배양에서 미리 코팅된 플레이트를 예열한다.</li>
	<li>LN-521 솔루션을 흡인합니다. 참고: LN-521 코팅의 손상을 방지하기 위해 우물 바닥과 흡인기의 직접적인 접촉을 피하십시오.</li>
	<li>줄기세포 유지보수 배지0.5mL을 새로 보충하여 10μM Rho 관련 키나아제(ROCK) 억제제 Y27632를 각각 24웰 플레이트 또는 0.05mL의 각 웰에 96웰 플레이트의 각 웰에 분배한다. 세포 시드를 준비할 때까지 접시를 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	<li>예정된 시드일(0일)과 70~80%의 hPSC 합류로, 6웰 플레이트의 우물 바닥에 자발적인 분화 부위를 표시한다. 참고: 자연분화는 위상 조영 현미경을 사용하여 세포 크기 및/또는 상이 다른 세포 형태학의 존재에 있는 총 변화에 의해 시각화될 수 있습니다.</li>
	<li>흡인 및 차별화의 표시된 영역과 우물에서 소비 된 매체를 폐기합니다. 실온(RT)에서 Ca2+/Mg2+ 없이 DPBS 1mL로 각각 잘 씻으십시오.</li>
	<li>효소가 없는 해리 시약 1mL(재료 표참조)를 각 우물에 넣고 37°C에서 8-10분 동안 배양하여 세포가 플레이트에서 눈에 띄게 분리될 때까지 배양합니다.</li>
	<li>셀 스크레이퍼를 사용하여 우물에서 세포를 부드럽게 분리합니다. P1000 파이펫으로 각 웰의 내용내용이 2-4배 위아래로 피펫되어 단일 셀 서스펜션을 생성합니다. 각 세포주에 대해, 모든 유지 보수 우물에서 멸균 50 mL 튜브로 풀 셀.</li>
	<li>줄기 세포 유지 보수 매체의 1 mL로 비워 각 세척. 적절한 세포주로부터 풀링된 세포를 포함하는 해당 튜브에 세체를 추가합니다.</li>
	<li>각 세포주에 대해 풀로 풀린 샘플에서 3개의 실행 가능한 셀 카운트를 수행합니다. 각 세포주에 대한 평균 라이브 셀 수(라이브 셀/mL)를 계산합니다.</li>
	<li>원심분리기는 RT에서 5분 동안 250 x g의 풀이 된 샘플을 흡인한 다음, 10 μM ROCK 억제제 Y27632로 새롭게 보충된 RT 줄기 세포 유지 보수 매체의 1-3mL에서 세포 펠릿을 재연합니다.</li>
	<li>각 세포주에 대해, 2.4 단계에서 준비된 우물수당 필요한 셀 수를 계산한다(표 1참조). 10 μM ROCK 억제제 Y27632로 새롭게 보충된 줄기 세포 유지 보수 매체로 필요한 세포 번호를 다시 중단합니다.</li>
	<li>이전에 추가된 볼륨을 제거하지 않고 2.4 단계에서 준비된 미리 코팅된 플레이트의 우물에 계산된 볼륨(들)을 추가합니다. 웰당 총 부피는 24웰 플레이트의 경우 1mL, 96웰 플레이트의 경우 0.1mL입니다. 접시를 좌우로 앞뒤로 부드럽게 흔들어 우물 전체에 세포 분산도 보장합니다. 참고: 우물 을 가로지르는 균등한 세포 분포는 균질성 세포 파종과 성공적인 분화를 보장하는 열쇠입니다.</li>
	<li>시드 플레이트를 인큐베이터에 넣고 시드 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 세포를 균등하게 분배하고 37°C 및 5% CO2에서배양을 유지한다.</li>
</ol>3. 라미닌-521에 간 선조에 hPSC를 차별화
<ol><li>올바른 첨가물로 보충된 Endoderm 기저매체를 사용하여 최종 엔도름 유도(1단계)를 위한 미디어를 준비한다.<ol>
<li>0일째에는 엔도름 기저형의 병을 4°C에서 하룻밤 동안 해동한다.</li>
		<li>필요에 따라 1단계 중간 1단계(1일째 에 사용)를 준비합니다.</li>
		<li>해동 보충 MR 및 얼음에 보충 CJ.</li>
		<li>희석 보충 MR 및 보충 CJ 1:100 엔도름 기초 매체에.</li>
		<li>필요에 따라 2-4일에 사용할 수 있는 1단계 중간 2단계를 준비합니다.</li>
		<li>희석 보충 CJ 1:100 엔도름 기초 매체에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>후속 간 선조 세포 사양(2단계) 분화를 위한 배지를 준비하여 간 선조 배지를 이용하여 한다.<ol>
<li>4일째에는 4°C에서 하룻밤 사이에 선조중의 병을 해동한다. 참고: 1% 페니실린/연쇄절제술(IU/mL 100μg/mL의 최종 농도)이 이 실험에 사용되었다. 항생제는 필요하지 않습니다; 항생제 사용은 사용자 재량에 따라 사용됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분화 첫날, 웰에서 10 μM ROCKi Y-27632 배지로 소비된 줄기세포 유지 보수 매체를 제거하고, 웰당 24개의 웰 플레이트당 0.5mL, 96웰 플레이트당 0.1mL로 대체한다.</li>
	<li>2일, 3일, 4일에는, 소비된 매체를 제거하고 96웰 플레이트당 24웰 플레이트 또는 0.1mL당 잘 1단계 중간 2의 0.5mL로 각각 잘 공급한다.</li>
	<li>5일째에, 면역 세포화학을 통한 최종 내분분 분석에 대한 우물을 수정한다. 나머지 우물의 경우, 소비된 배지를 제거하고 각각 0.5mL의 간 선조 분화 배지를 잘 공급하여 24웰 플레이트 또는 96웰 플레이트당 0.1mL에 대해 잘 한다. 6일, 7일, 9일에 다시 배지를 새로 고칩니다.</li>
	<li>10일째에, 간 선조 분화 분석을 위한 우물을 수확하거나 추가 간세포 와 같은 세포 분화를 진행한다. 참고: 이 시점에서, 시료는 면역세포화학 분석을 위한 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정되거나, 엘리사및 세포를 위해 수집된 수퍼나일제는 단백질 정량화를 위해 수집되었다.</li>
</ol>4. 라미닌-521에 hPSC에서 생성된 간 선조 분화 배양의 특성화
<ol><li>5일째에 면역스테인링을 사용하여 최종 엔도름 특이적 마커의 발현을 감지합니다.</li>
	<li>10일째에 면역염색을 사용하여 간 선조 특이적 마커의 발현을 감지한다.</li>
	<li>10일, 제조사의 지시에 따른 키트를 사용하여 ELISA를 통한 AFP 및 ALB 분비를 측정하고, 비신천산(BCA) 단백질 분석서에 의해 결정된 대로 mg 단백질당 정상화한다.</li>
	<li>잘 결합된 HNF4α 양성세포의 백분율을 정량화하여 96웰 플레이트의 간 전구 가변성을 평가한다.</li>
</ol>5. 면역 세포 화학 및 이미지 수집
<ol><li>5일과 10일, 1x DPBS로 3배, 웰당 0.5mL, 웰당 0.1mL로 96웰 플레이트. RT에서 2-5 분 동안 부드러운 흔들림으로 접시를 배양하십시오. 참고: 면역 세포화학에 대해 Ca2+/Mg2+ 없이 DPSB를 사용하십시오.</li>
	<li>15-30분 동안 RT에서 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 고정하여 우물당 0.3mL의 PFA를 24웰 플레이트에 추가하고 96웰 플레이트당 0.1mL를 첨가한다.</li>
	<li>5.1 단계에서 설명한 대로 1x DPBS로 3배 세척합니다.</li>
	<li>PBST로 멤브레인을 0.1% Tween, 1x DPBS를 사용하여 멤브레인을 20분 동안 배양하고, 96웰 플레이트당 24개의 웰 플레이트당 PBST0.3mL, 0.1mL를 추가하여 RT에서 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>1 시간 동안 PBST에서 10% BSA로 세포를 배양하고, 우물당 0.3mL의 BSA를 추가하고 96웰 플레이트당 BSA의 0.1mL을 추가하여 플레이트 셰이커를 사용하여 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
	<li>단백질 차단 후, 차단 용액을 PBST에서 1% BSA로 희석된 1차 항체로 대체하고 4°C에서 하룻밤 동안 부드러운 흔들림으로 배양한다. 참고: 단백질 블록과 항체 첨가 사이에 세척하지 마십시오.</li>
	<li>24 시간 후, PBST와 함께 3 배 우물을 씻으라.</li>
	<li>PBST에서 1% BSA에 이차 항체를 추가합니다. 부드러운 흔들림으로 어둠 속에서 RT에서 1 h를 배양하십시오.</li>
	<li>이차 항체 인큐베이션 후, 1x DPBS로 우물 3배를 씻고, 부드러운 흔들림으로 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 제조업체의 지시에 따라 Hoechst 얼룩을 분배하십시오.</li>
	<li>1x DPBS로 3배 세척합니다. 플레이트는 이제 이미징을 할 준비가 되었습니다. 참고: 이미징까지 어두운 4°C에 접시를 저장합니다.</li>
	<li>면역 조직 화학 후 고함량 이미징 현미경을 사용하여 다중웰 플레이트를 이미지합니다. 여러 뷰 필드의 이미지 수집은 우물의 진정한 표현을 얻는 것이 좋습니다. 상이한 마커의 발현은 상용 소프트웨어를 이용한 세포 세분화 분석을 통해 평가하였다(재료표참조)(도 1). 참고: 셀 프로파일러 또는 피지20,21과같은 이미지 분석 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 셀 세분화도 수행할 수 있다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+liver+diseases+in+the+world.">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li><li>Szkolnicka, D., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Advances+in+Generating+Hepatocytes+from+Pluripotent+Stem+Cells+for+Translational+Medicine.">Concise Review: Advances in Generating Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells for Translational Medicine.</a> Stem Cells Dayton Ohio. 34 (6), 1421-1426 (2016).</li><li>Heslop, J. A., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+for+Modeling+Liver+Development+and+Disease.">The Use of Human Pluripotent Stem Cells for Modeling Liver Development and Disease.</a> Hepatology. 69 (3), 1306-1316 (2019).</li><li>Alwahsh, S. M., Rashidi, H., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cell+therapy:+is+this+the+end+of+the+beginning.">Liver cell therapy: is this the end of the beginning.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 75 (8), 1307-1324 (2018).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells Dayton Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -. P., Touboul, T., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8 (2), 430-437 (2013).</li><li>Basma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocytes.">Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Khetani, S. R., Blanco, J. G., Iredale, M., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Human+Tissue:+Platforms+to+Evaluate+Drug+Metabolism+and+Safety.">Pluripotent Stem Cell-Derived Human Tissue: Platforms to Evaluate Drug Metabolism and Safety.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 20 (2017).</li><li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+and+development+of+the+liver.">Organogenesis and development of the liver.</a> Developmental Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Shin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp+and+Fgf+signaling+are+essential+for+liver+specification+in+zebrafish.">Bmp and Fgf signaling are essential for liver specification in zebrafish.</a> Development Cambridge England. 134 (11), 2041-2050 (2007).</li><li>DeLaForest, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HNF4A+is+essential+for+specification+of+hepatic+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">HNF4A is essential for specification of hepatic progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Development Cambridge England. 138 (19), 4143-4153 (2011).</li><li>Baxter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+analyses+show+stem+cell-derived+hepatocyte-like+cells+better+mimic+fetal+rather+than+adult+hepatocytes.">Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes.</a> Journal of Hepatology. 62 (3), 581-589 (2015).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Domogatskaya, A., Rodin, S., Boutaud, A., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+but+Not+-332,+-111,+or+-411+Enables+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Self-Renewal+In+Vitro.">Laminin-511 but Not -332, -111, or -411 Enables Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal In Vitro.</a> Stem Cells. 26 (11), 2800-2809 (2008).</li><li>Kanninen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+and+laminin-521-based+matrices+for+efficient+hepatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 103, 86-100 (2016).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+Production+of+Hepatocyte+Like+Cells+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57995 (2018).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Raven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+act+as+Facultative+Liver+Stem+Cells+during+Impaired+Hepatocyte+Regeneration.">Cholangiocytes act as Facultative Liver Stem Cells during Impaired Hepatocyte Regeneration.</a> Nature. 547 (7663), 350-354 (2017).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functional+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism.">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).</li><li>Medine, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+High-Fidelity+Hepatotoxicity+Models+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Developing High-Fidelity Hepatotoxicity Models from Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55355 (2017).</li><li>Villarin, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Supported+Directed+Differentiation+Reveals+a+Unique+Gene+Signature+Predicting+Stable+Hepatocyte+Performance.">Polymer Supported Directed Differentiation Reveals a Unique Gene Signature Predicting Stable Hepatocyte Performance.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1820-1825 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li></ol>

데이비드 C. 헤이는 스템노바테 주식회사의 공동 창립자이자 주주입니다. 나머지 저자는 이 문서에서 논의된 주제나 자료에 대한 이해상충이 없음을 증명합니다.

대규모로 만능 줄기 세포로부터 인간 간 전구 세포의 생성은 시체 유래 물질에 대한 유망한 대안을 나타낼 수 있습니다. 프로토콜 표준화 및 재현성은 생체 의학 연구에 대한 기술 번역 및 영향을 보장하는 데 핵심적입니다. 이를 해결하기 위해, 이전 작품은 정의된 첨가제 및 매트릭스 15,23,24,25,26,27,28을사용하여 hESC 및 iPSC로부터 단계적 차별화 프로토콜을 개발하는 데주력하고 있다. 이를 통해, 간세포 표현형 및 재현성이 개선되어 분화공정(19)의반자동화를 허용한다. 제시된 시스템은 기성 세포 배양 매체 및 촉진 간세포 분화 시스템과의 조합으로 강화됩니다.
이전에는 분화 프로토콜이 시작되기 전에 만능 세포 밀도가 간 선조 세포의 균질한 집단을 달성하기 위한 핵심 변수로강조되었다(26). 이러한 보다 정제된 절차를 이용하여, 다양한 세포밀도(표 1)를이용하여 단계적으로 줄기세포 유래 간 전구체를 단계적으로 생성할 수 있다. 5일째, 최종 엔도름 유도는 Sox17염색(도 3)에의해 검증되었다. 최종 엔도름으로 효율적이고 견고한 분화는 테스트된 ESC 및 iPSC 라인 모두에서 달성되었으며, 80% 이상이 Sox17(그림3)을발현했습니다. 10일째에, 간 선조들은 균일한 조약돌 같이 형태를 보였고, 간 줄기세포 마커는 AFP와 HNF4α(>86%, 도 4)에대해 높게 농축되었다. 수동 및 반자동 기술의 조합을 사용하여 다중 플레이트포맷(19)에서차별화를 수행할 수 있었다.
현재 의 형태로, 세포 분화는 시험관 내 실험에 적합합니다. 그러나, 세포 농축은 간 선조의 균질한 인구가 납품을 위해 준비된다는 것을 확인하기 위하여 임상 신청 의 앞에 요구될 것입니다.
결론적으로, 여기서 설명된 프로토콜은 대규모로 간 선조를 생성하는 표준화된 접근법을 필드에 제공한다. 향후 작업은 후속 HLC 차별화, 성숙 및 유지 보수를 위한 새로운 매체의 생산에 초점을 맞출 것입니다.

간 질환은 전 세계적으로 연간 약 2백만 명의 사망을 초래하는 글로벌 건강 문제를 나타냅니다1. 많은 모델 시스템이 간 질환을 연구하고 임상적으로 개입하기 위해 존재하지만, 세포 기반 시스템의 일상적인 사용은 상당한 단점에 의해 제한됩니다 (검토를 위해 Szkolnicka 외.2참조). 첨단 인간 다능성 줄기세포(hPSC) 배양 및 체세포 분화 방법은 클리닉3,4를위한 분화세포의 기본 생체 의학 연구 및 재생 가능한 공급원을 위한 도구를 개발하는 유망한 기술을 나타낸다.
현재까지, 간세포형 세포(HLC)를 위한 다중 프로토콜이 개발되었다5,6,7,8. 이러한 프로토콜은 작은 분자와 성장 인자의 조합을 사용하여 인간 간 발달의 측면을 재현하려고9,10. 대부분의 프로토콜은 hPSC가 최종 종말에 준비되어 있는 단계별 분화 과정으로 구성되며, 그 다음으로 간 선조 사양11,12,13,HLC 사양으로 끝납니다. 이러한 프로토콜에 의해 생성된 HLCs는 태아와 성인용 표현형의 혼합물을 표시합니다. 여기에는 HNF4α 및 알부민(ALB)과 같은 간세포 마커와 같은 알파 페토프로틴(AFP)의 발현뿐만 아니라 약물 대사용량(14,15,16)이 포함됩니다. 실험실 간에 HLC 분화는 다를 수 있습니다. 따라서 표준화된 프로토콜의 개발이 필요합니다. 이를 통해 연구자들은 기본 및 임상 연구를 위해 줄기 세포 에서 파생된 HLC를 대규모로 효과적으로 생성하고 적용할 수 있습니다.
간 선구분화 시스템은 따르기 쉬운 지침을 사용하여 인간 배아 및 유도된 만능 줄기 세포주 모두에 적용될 수 있는 개발되었다. 이 절차는 세포 배양 플라스크에서 96 개의 웰 플레이트에 이르기까지 다양한 배양기 형식으로 간 선조의 균질한 인구를 산출합니다. 아래 제공된 프로토콜은 줄기 세포 유래 간 선조를 24 및 96 웰 포맷으로 생산하는 프로토콜이다.
아래에 제시된 프로토콜에 사용되는 세포 밀도는 각각 24 및 96 웰 플레이트의 한 웰에 대해 지정됩니다(표 1참조). 상이한 세포 배양 플레이트 포맷 및 세포주에 대해 시작 세포 수의 최적화가 요구된다. 프로토콜 최적화를 위한 제안된 시작 세포 밀도는 2 x 105 세포/cm2이다. 밀도 최적화를 위해, 한 번에 50,000개의 세포/cm2를 ± 추가하여 여러 세포 밀도를 테스트할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DPBS with Calcium and Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Gentle cell dissociation reagent</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Ready Flow Reagent</td><td>thermofisher</td><td>R37165</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>1190</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Operetta High-Content Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ</td><td>STEMCELL Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Endoderm Basal Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Hepatic Progenitor Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>Alpha-fetoprotein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8452</td><td>1:400 (mouse)</td></tr><tr><td>HNF-4&amp;alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (rabbit)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Sox17</td><td>R&amp;amp;D Systems, Inc.</td><td>AF1924</td><td>1:200 (Goat)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columbus Image Data Storage and Analysis system</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hepatic progenitor specification from pluripotent stem cells using a defined differentiation system

간 질환은 증가하는 글로벌 건강 문제입니다. 간 이식은 치료의 효과적인 모드인 동안, 기증자 기관 가용성에 있는 부족으로 인해 환자 사망률이 증가했습니다. 장기 부족은 또한 기본적인 연구 및 진료소를 위한 인간 간세포의 일상적인 공급에 영향을 미칩니다. 따라서 인간 간 전구 세포의 재생 가능한 소스의 개발이 바람직하며이 연구의 목표입니다. 인간 간 전구를 대규모로 효과적으로 생성및 배치할 수 있도록, 재현가능한 간 선조 분화 시스템이 개발되었다. 이 프로토콜은 다양한 세포 배양기 형식의 사용자 간의 실험 재현성을 돕고 인간 배아 및 유도된 만능 줄기 세포주를 사용하여 분화를 허용합니다. 이들은 기본적인 연구를 강화하고 임상 제품 개발을 향해 길을 열 수 있습니다 현재 분화 시스템에 비해 중요한 장점이다.

hESC(H9) 및 hiPSC(P106) 라인에서 간 선조 분화는 도 2에기재된 단계별 프로토콜에 따라 수행되었다. 여기서, 만능 줄기 세포는 분화의 개시 전에 LN-521 코팅 판으로 단하나 세포로 종자하였다. 세포 합류는 견고하고 재현 가능한 분화를 위한 핵심입니다. 일단 올바른 합류가 달성되면(그림 2),차별화가 시작되었다. 5일째에, 최종 엔도름 사양은 Sox17 발현을 통해 평가되었다. 두 세포주에서 Sox17은 H9 및 P106에 대해 Sox17 양성 세포의 0.5%± 0.5%와 87.8%로 각각 80%± 높게나타났다(그림 3). 10일째에, 간 선조는 조약돌 같이 모양체를 표시했습니다(그림 2). 또한, 간 선조 사양은 HNF4α, AFP, ALB 및 사이토케라틴-19(CK19) 발현뿐만 아니라 AFP 및 ALB 단백질 분비10,15,22(도 4)에대해 평가되었다. H9과 P106 간 배구모두 HNF4α(91% ± 0.5%, ± 0.2%), AFP(89.7% ± 1.8%, ± 1.2%), CK19(78.5%± 3.2%, 83.6%)±.8%)과 같은 태아간 마커를나타냈다. AFP 분비액은 10일째 에 두 세포주(32.4± 1.6 및 47.8 ± 5.9 ng/mL/mg/24h)에서 검출되었다(그림5). 알부민 합성은 낮은 수준(30.7% ± 1.8%, 27.2% ± 1.1%)으로 관찰되었으며ELISA(그림4)를통해 검출되지 않았다.
이 프로토콜은 24웰에서 96개의 웰 플레이트까지 간 선조의 표준화된 생산을 허용했습니다. 반자동 파이프라인은 H9 및 P106 세포주로부터 96개의 잘 플레이트를 생산하기 위해 이전에 설명된17과같이 사용되었다. 세포 수 가변성 및 간 선조 분화 효율은 HNF4α 발현의 정량화를 통해 평가되었다. 세포 세분화는 고함량 이미징기기(도 1)를이용하여 면역형광을 통한 단백질 정량화를 위해 수행되었다. 10일째에, 간 선조들은 H9에 대해 HNF4α 양성세포의 94% >94%, P106에 대한 HNF4α 양성세포 97%를 가진 행에 걸쳐 유의한 가변성을 나타내지않았다(그림 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2.jpg"> 도 1: 세포 세분화 파이프라인 개요. (A)원이미지를 사용하여(B)핵 염색이 핵 분할에 사용되었다. (C)형상 및 크기에 기초한 핵 세분화 품질 관리 단계는 명확하게 분할된 핵을 정량화하기 위해 수행되었다. (D)이에 따라 양성 HNF4α-스테인드 핵을 정량화하였다. (E)마지막으로, 강도 기반 임계값은 HNF4α-발현 세포를 식별하기 위해 사용되었다. C와 E에서,녹색 핵은 선택된 세포를 나타내고 마젠타 핵은 버려진 세포를 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2.jpg"> 도 2: hPSC로부터의 간 선조 분화. (A)간 선구 분화 프로토콜의 회로도 표현. (B)분화 시 형태학적 변화를 강조하는 대표적인 이미지. 0일째(D0)에서 hPSC는 셀의 포장된 단층층을 제시했습니다. 이에 따라 hPSC는 5일째(D5)에 최종 엔도드름으로 준비되었습니다. 이것은 10일째 (D10)에 간 선조 분화에 선행되었습니다. 간 선조는 조약돌 같은 세포 형태를표시했다. 스케일 바 = 75 μm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2.jpg"> 그림 3: 최종 엔데덤 사양의 특성화. 5일째에, 세포는 Sox17, 결정적인 엔도드름 마커를 위해 염색되었습니다. Sox17 양성 세포의 비율은 80 ± H9에 대 한 0.5% 및 87.8 p106에 대 한 0.5%±. 백분율 정량화는 10개의 개별 우물을 기반으로 하며, 6개의 필드가 잘 볼 수 있습니다. 데이터는 평균 ± SEM. Scale 막대 = 50 μm로 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig3v2large.jpg" target="_blank">표시됩니다.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3.jpg"> 그림 4: 간 선조 특성. 10일째에, 간 선조들은 간마커(A)HNF4α,(B)AFP 및(C)ALB를 위해 염색되었다. H9의 경우, 양성세포의 비율은 각각 91%, ± 0.4%, 89.7%± 1.8%, 30.7%로 HNF4α, AFP, ALB의 경우 각각 1.8%±. P106의 경우, 양성 세포의 비율은 각각 HNF4α, AFP 및 ALB에 ± 대해 각각 0.2%, 86% +/- 1.2%, 27.2%± 90%였다. (D)Cholangiocyte 계보 잠재력은 CK19 발현을 통해 평가되었다; H9 유래 간 선조는 3.2% CK19 양성 세포를 ± 78.5%를 표현한 반면, 83.6%는 CK19 양성 세포의 ± 1.8%가 P106 간 선조인을 관찰하였다. 면역글로불린 G(IgG) 염색은 염색 제어로서 사용하였다. 백분율 정량화는 10개의 개별 우물을 기반으로 하며, 6개의 필드가 잘 볼 수 있습니다. 데이터는 평균 ± SEM. Scale 막대 = 50 μm로 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig4v3large.jpg" target="_blank">표시됩니다.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig5.jpg"> 그림 5: 간 선조 단백질 분비 분석. 알파 페토프로틴(AFP)과 알부민(ALB)의 분비액은 H9과 P109에서 10일째에 간 선조 배양에서 분석되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제를 나타내고 오류 바는 SD를 나타내고, 분비단백질은 단백질의 mg당 mL당 분비 단백질의 나노그램으로서 24h 배양 배지로부터 정량화되었다, n = 3; ND = 감지되지 않습니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2.jpg"> 그림 6: 96 웰 플레이트에서 잘 가변성 평가. (A)HNF4α로 염색된 H9 유래 간 선조의 96웰 플레이트 뷰의 시각화. (b)HNF4α 양성 세포의 정량화. 잘 정량화 당 보기의 여섯 필드에서 행에서 잘 당 셀 수의 평균. 플레이트 전체의 평균 세포 수는 94.81%± 0.22 SEM HNF4α-양수 세포당 양수였다. 우물 사이에통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다. (C)HNF4α로 염색된 P106 유래 간 선조의 96웰 플레이트 뷰의 시각화. (D)HNF4α 양성 세포의 정량화. 우물당 평균 셀 수( 잘 및 정량화된 6개의 시야 필드)에서 행의 평균 셀 수입니다. 플레이트 전체의 평균 세포 수는 97.7%± 0.57 SEM HNF4α-양수 세포당 양수였다. 행 간에 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. 웰 H12는 면역글로불린 G(IgG) 염색 제어로 사용되었다. 스케일 바 = 1mm. 투키의 포스트 혹 이후 통계 시험을 통해 일방적인 ANOVA가 채택되었습니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61256/61256fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>플레이트 형식</td>
			<td>표면적(cm2)</td>
			<td>cm2당 세포</td>
			<td>우물당 총 세포</td>
			<td>디스펜싱 볼륨(mL)</td>
			<td>세포 농도(세포/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>24웰 플레이트</td>
			<td>1.9</td>
			<td>210526</td>
			<td>400000</td>
			<td>0.5</td>
			<td>800000</td>
		</tr>
<tr>
<td>96웰 플레이트</td>
			<td>0.32</td>
			<td>187500</td>
			<td>60000</td>
			<td>0.05</td>
			<td>1200000</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 이 프로토콜에 사용되는 hPSC 세포주상이 다른 플레이트 포맷에 대해 권장되는 세포 밀도.

Watch this Scientific Journal Video about Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System at JoVE.com

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

hepatic-progenitor-specification-from-pluripotent-stem-cells-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

4.6K 조회수.  University of Edinburgh. 이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

비디오: Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

연구

발생학

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial cells, which line blood vessel lumens, from human pluripotent stem cells is crucial for a multitude of tissue engineering and regeneration applications. In vivo, primordial endothelial cells are derived from the mesodermal lineage and are specified toward specific subtypes, including arterial, venous, capillary, hemogenic, and lymphatic. Hemogenic endothelial cells are of particular interest because, during development, they give rise to hematopoietic stem and progenitor cells, which then generate all blood lineages throughout life. Thus, creating a system to generate hemogenic endothelial cells in vitro would provide an opportunity to study endothelial-to-hematopoietic transition, and may lead to ex vivo production of human blood products and reduced reliance on human donors. While several protocols exist for the derivation of progenitor and primordial endothelial cells, generation of well-characterized hemogenic endothelial cells from human stem cells has not been described. Here, a method for the derivation of hemogenic endothelial cells from human embryonic stem cells in approximately 1 week is presented: a differentiation protocol with primitive streak cells formed in response to GSK3&#946; inhibitor (CHIR99021), then mesoderm lineage induction mediated by bFGF, followed by primordial endothelial cell development promoted by BMP4 and VEGF-A, and finally hemogenic endothelial cell specification induced by retinoic acid. This protocol yields a well-defined population of hemogenic endothelial cells that can be used to further understand their molecular regulation and endothelial-to-hematopoietic transition, which has the potential to be applied to downstream therapeutic applications.

Presented here is a simple protocol for the directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells in approximately 1 week.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...