이 프로토콜은 이 축적을 조절할 수 있는 메커니즘과 치료를 연구하기 위한 1차 도파민 뉴런에 알파 시뉴클레인 축적의 견고하고 재현 가능한 모델을 제공합니다. 사전 형성된 알파-시뉴클레인 피브릴은 자동화된 이미징 및 편견없는 이미지 분석과 결합된 점진적이고 재현가능한 단백질 축적을 유도하며, 이 프로토콜은 알파 시뉴클레인 축적 억제 트럭의 비교적 빠르고 중간에서 높은 처리량 스크리닝을 용이하게 합니다. 진보적인 알파-synuclein 축적 파 킨 슨 병 및 특정 핵 체에서 신경 기능을 손상 하는 요인 중 하나가 될 수 있습니다.
그 같은 축적을 막는 새로운 분자는 신경 변성을 위한 새로운 치료가 될 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 도파민 뉴런에 있는 알파-synuclein 축적을 조절하는 분자 기계장치를 연구하기 위한 표준적이고 믿을 수 있는 공구를 설치하기 위한 중요한 단계이다는 것을 믿습니다. 절차를 시연하는 것은 줄리아 코노발로바, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다.
1차 배아 중뇌 세포 배양을 설정하기 전에, 도파민의 마이크로리터 50마이크로리터, 뉴런 배지, 폴리-L-Ornithine 코팅 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 100 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 매질의 바닥을 순환 방향으로 동시에 긁으면서 각 우물의 바닥을 순환 방향으로 긁어내고 각각의 둘레에서 코팅을 제거합니다. 폴리 L-오르니틴 코팅 섬은 각 우물의 중간에 남아있을 것입니다. 각 코팅 된 섬의 중간에 10 마이크로 리터를 추가하여 마이크로 섬을 만듭니다.
마우스 배아의 날 13.5 마우스 배아에서 1 차적인 배아 중뇌 배양을 설정합니다. 수확한 모든 중뇌 바닥을 동일한 1.5 밀리리터 튜브로 풀을 짜고, 세척당 500마이크로리터의 칼슘과 마그네슘 프리 HBSS로 샘플을 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 HBSS를 섭씨 37도에서 30분 동안 0.5%의 트립신으로 대체합니다.
인큐베이션의 끝에 는 부분적으로 소화된 조직에 FBS 용액에 새로 준비된 DNase I의 500 마이크로리터를 추가하고 소화된 조직에 불을 닦은 팁이 있는 실리콘 유리 파이펫을 사용하여 조직을 세타게 합니다. 작은 입자만 관찰될 때, 이러한 조직 단편이 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 정착하고 이 상신을 빈 15 밀리리터 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮길 수 있게 한다. FBS에 DNase I를 포함하는 튜브에 HBSS 1 밀리리터를 추가하고 파이펫팅하여 여러 번 혼합합니다.
이 용액의 1밀리리터를 나머지 조직 입자에 옮기고 샘플을 다시 세리하게 합니다. 그런 다음 HBSS 퇴적물에서 남은 DNase I 및 FBS로 남은 DNase I 및 FBS로 한 번 더 조직 샘플을 세티프로 팅한 후 남은 조직 단편을 전달하지 않고 상체관으로 소화된 세포 현탁액을 당기고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 흡습한다. 세척 당 따뜻한 도파민 뉴런 배지의 두 밀리리터에 세포를 두 번 세척.
그리고 마이크로 원심분리기 튜브에서 신선한 따뜻한, 중간 농도의 6 개의 마이크로 리터 당 3 배 10에서 세포를 다시 중단합니다. 다음으로 이전에 준비된 각 마이크로 섬에서 배지를 제거하고 10 마이크로리터 파이펫을 사용하기 전에 세포를 부드러운 파이펫팅과 혼합하여 각 마이크로 섬에 6 마이크로리터의 셀을 추가합니다. 모든 세포가 첨가되면 150 마이크로리터의 물 또는 PBS로 플레이트 가장자리의 빈 우물을 채우고 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
인큐베이션의 끝에 100 개의 신선한 도파민 뉴런 배지의 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 라미나르 유동 후드의 세포 배양 8일째에는 각 실험에 3.75 마이크로리터의 100 마이크로그램을 첨가하고 각 실험에 PBS의 마이크로리터가 잘 들어있다. PFS와 함께 작업 할 때 원치 않는 단백질 오염에 대해 신중하고 그 후 후드와 1 % SDS 및 70 %에탄올과 모든 PF 관련 기기를 청소하십시오.
관심 있는 마커에 대한 염색 후 적절한 실험 적 엔드 포인트에서 96 개의 웰 배양 판을 10 X 목표가 장착 된 고함량 플레이트 스캐너에 로드합니다. 플레이 타입, 제조사, 크기, 우물 간 거리, 배지의 종류 및 부피와 같은 96웰 플레이트의 사양에 따라 설정을 조정한다. 각 마이크로 섬의 모든 세포를 커버하기 위해 우물의 이미징 영역을 선택하고 DAPI 발현에 자동 초점을 조정하기 위해 잘 하나를 사용합니다.
대조군 유정에 얼룩의 강도에 기초하여 각 형광 채널에 대한 획득 시간을 보정하고 세포 소마 내의 인포세린 129 알파 시뉴클레인 골재를 수용하는 전형성 된 섬유 처리 제어 우물의 도파민 세포가 명확하게 인뉴클레오 19 및 포이큐어 의 명확한 정량화를 허용하도록 파라미터를 조정한다. 그런 다음 각 웰에 대해 정확히 동일한 매개 변수를 사용하여 모든 채널에서 선택한 모든 우물을 동시에 이미지화합니다. 이미지 분석을 위해 CellProfiler 분석가를 열고 V2_THpos 선택합니다.
속성 파일입니다. 분할된 세포를 인포세린(129) 알파 시뉴클레인 양성 및 음수 세포로 분류하려면 먼저 50개의 무작위 세포로 가져오기 세포의 수를 설정하고 가져오기를 클릭하여 분할된 세포의 이미지를 로드합니다. 적어도 30개의 셀을 창 하단의 해당 저장소로 드래그합니다.
50 최대 규칙 또는 무작위 포리스트 분류기와 빠른 부드러운 증폭을 사용하여 선택기차. 50개의 양양성 세포로 가져오기를 설정하고 가져오기를 클릭하여 열차 분류기에 따라 득점된 양성 인인 129 알파 시뉴클레인 세포를 획득하거나 50개의 음세포로 가져오기를 설정하고, 열차 분류자에 따른 네거티브 인(129) 알파 시뉴클레인 세포를 획득하기 위해 가져오기를 클릭한다. 결과가 만족스러울 때, 모두 점수를 클릭하여 인포세린 129 알파 시뉴클레인 의 수와 음의 도파민 뉴런을 각 웰에 요약한 결과 표를 생성한다.
균일하게 확산 된 문화를 도금 한 후 며칠 은 도금 전에 생성 된 마이크로 섬 내의 빛 현미경 검사법에 의해 관찰 될 수있다. 1 차적인 뉴런은 코팅 된 플레이트 바닥에 균일하게 정착하고 신경 투영을 확립합니다. 이 이미지에서는 직경이 150 마이크로 미터 미만인 작은 덩어리를 관찰할 수 있다.
도금 후 15일 후 신경세포 마커를 가진 대조군 치료되지 않은 1차 마우스 중간뇌 배양의 면역 염색은 플레이트 웰의 중간에 있는 마이크로 섬 내의 세포의 제한된 부착을 드러낸다. 티로신 하이드록실라제 마커로 표기된 도파민 뉴런 면역은 덩어리없이 서로 분리된 단층으로 마이크로 섬 주위를 퍼짐합니다. 알파-시뉴클레인 전형성 피브릴 처리 배양에서, pS129 알파 시뉴클레인 양성 포함도 관찰될 수 있다.
7 일 동안 체외 사전 형성 된 섬유를 가진 치료는 다른 실험 그룹에 비해 티로신 하이드록실라제 양성 뉴런 수의 현저한 감소를 일으키지 않는다. 신경교 세포주 유래 신경 영양 인자 그러나 치료, pS129 알파-시뉴클레인 양성 포함의 비율을 감소, 항로신 하이드록실라제 양성 도파민 뉴런을 수용. 마이크로 섬을 만들기 전에 폴리 L 오니틴 코팅 우물이 단단히 세척되어 있는지 확인하십시오.
또한 새로운 뇌 문화를 도금 할 때 신선한 미디어를 사용해야합니다. 이 방법은 유전자 편집 및 약리학적 억제제와 결합하여 특정 유전자의 효과와 핵 응집에 대한 생각파를 연구할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 알파 synuclein 축적을 억제 하는 새로운 분자에 대 한 검사이 방법을 사용.
TDN의 축적 보호 효과를 입증하고 현재 여러 개의 작은 후보 분자를 분석하고 있다.
