최소한의 세포 설계 및 약물 전달을 위한 수프라 분자 구조의 효율적인 조립은 여전히 어려운 일입니다. 여기서, 우리는 양용 성 엘라스틴과 같은 단백질을 기반으로 수분자 구조를 산출하는 효율적인 프로토콜을 보여줍니다. 제시된 조립 프로토콜은 소포, 섬유 및 동서와 같은 적응 가능한 물리화학적 특성을 가진 다목적 수분자 구조를 생성합니다.
단백질 멤브레인 기반 구획은 상 분리 거동을 보여주고 화학적으로 다양한 형광화물 분자의 캡슐화를 허용합니다. F20E20-mEGFP 및 F20E20-mCherry의 표현을 위해, 1박 전문화에서 0.3의 OD600까지 의 주요 표현 문화를 접종한다. 37섭씨 와 200 rpm에서 적절한 항생제로 보충된 멸균 LB 배지의 400 밀리리터에서 배양하십시오.
발현 배양은 0.5 ~0.8의 OD600에 도달하면 IPTG를 1밀리머의 최종 농도에 추가하고 인큐베이션 온도를 섭씨 20도로 낮춘다. 부자연스러운 아미노산을 가진 수륙양용 ELP의 발현을 위해, 0.3의 OD에 적합한 플라스미드를 포함하는 야간 대장균 전 배양으로부터 주요 발현 문화를 접종한다. 카나마이신과 클로람페니콜을 섭씨 37도, 200rpm에 보충한 멸균 LB 배지 400밀리리터로 인큐베이션을 증식합니다.
100 밀리풀라 부자연스러운 아미노산 육수를 준비하려면 206.2 밀리그램의 부자연스러운 아미노산을 초순수 수의 8 밀리리터에 추가하십시오. 용액의 pH를 수산화 나트륨 3마리로 올리고 적극적으로 섞습니다. 부자연스러운 아미노산이 용해되면 pH를 약 10.5로 낮추고 초순수수를 10밀리리터의 부피에 추가합니다.
멸균 0.22 마이크로미터 필터로 용액을 걸러내고 2밀리리터 반응 튜브로 알리쿼트합니다. 발현 배양은 0.5 ~0.8의 OD600에 도달하면, 2밀리머의 최종 농도에 부자연스러운 아미노산을 첨가한다. 10 분 더 배양.
그런 다음 IPTG 및 아라비노스의 동시 첨가를 통해 표적 단백질 및 필요한 tRNA 합성제의 발현을 유도한다. 인큐베이션 온도를 섭씨 20도로 낮추고 식이 약 20시간 동안 계속되도록 합니다. 인큐베이션 후, 40분 동안 4도, 000배 g에서 원심분리로 세포를 수확한다.
리소지메 및 PMSF로 리시스 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 얼음에 30 분 동안 솔루션을 인큐베이션합니다. 그런 다음 액체 질소에 잠기면 두 번 동결하고 해동하십시오.
서스펜션을 초음파 처리하고 10, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 원심 분리로 lysate을 40 분 동안 취소합니다. 그런 다음 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정화합니다. 단백질 용출 후 추가 사용이 될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오.
ELP 용액 500 마이크로리터에 형광 염료 1개를 추가하고 ThermoMixer에서 흔들리는 동안 섭씨 15도에서 약 10시간 동안 반응을 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 과도한 형광염을 제거하려면 초순수 수역에서 투석 막을 10분 동안 평형화합니다. 멤브레인을 올바른 크기로 잘라 서 응고 된 ELP 용액을 사용하여 반응 튜브의 개구부 위에 놓습니다.
그런 다음 코어가없는 뚜껑으로 튜브를 닫아 멤브레인을 개구부로 고정합니다. 공기의 트래핑을 방지하기 위해 뚜껑과 멤브레인 사이의 공간을 버퍼로 채웁니다. 그런 다음 반응 튜브를 선택한 버퍼에 넣고 표면 아래로 밀어 거꾸로 놓습니다.
섭씨 4도에서 적어도 3시간 동안 투석을 수행하여 각 버퍼 변경 후 투석이 적어도 3시간 이상 계속될 수 있도록 합니다. THF 팽윤의 경우, 안정적인 pH 7.5로 인산염 또는 트리스 버퍼에 대해 균질한 ELP 용액을 투석한다. 리오필라이저를 준비하고 동결 건조를 위해 온도를 시동하도록 식힙니다.
Aliquot는 1.5 밀리리터 반응 튜브에서 투석 된 단백질 용액을 인용하고 동결 건조 과정에서 압력 변화로 인해 고체 샘플을 잃지 않도록 작은 구멍이있는 캡으로 밀봉하십시오. 액체 질소에 있는 견본을 충격 동결합니다. 냉동 단백질 샘플을 액체 질소에서 꺼내 서 즉시 동결 건조를 시작 하는 lyophilizer에 배치 합니다.
시료가 완전히 건조한 후, 건조한 질소로 환기시키고 반응 튜브 뚜껑을 즉시 닫아 공기 습기와의 접촉을 피하십시오. lyophilized 샘플에 순수 THF를 추가하고 15 분 동안 얼음 물이있는 수조 초음파 식소식에 용액을 넣습니다. 열순환기를 섭씨 30~60도로 예열하여 소포 형성을 위해 섭씨 30도 또는 섬유 형성을 위해 섭씨 90도까지 예열하고, 초순수 수또는 완충액으로 새로운 반응 튜브를 준비합니다.
초음파 처리 후 ELP/THF 용액과 준비된 물 또는 버퍼를 5분 동안 열순환기에 배치합니다. 그런 다음 ELP 용액을 물 이나 버퍼 위에 계층화하여 두 단계와 뚜렷한 상호 위상의 분리가 보이는지 확인하고 혼합물을 열순환기에 다시 배치합니다. 샘플을 실온에서 10 분 동안 식히고 물 이나 버퍼 또는 형광 현미경 검사법에 대한 투석을 진행하십시오.
일대일 50 마이크로몰라 ELP 용액을 준비하고 10~20%에서 20%1-부타놀을 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 즉시 용액을 섞는다. 용액의 탁도는 혼합 하는 동안 증가 해야 합니다., 소포 형성을 나타내는.
좁은 크기 분포를 달성하기 위해, 하나의 마이크로 미터의 모공 크기와 멤브레인을 통해 미니 압출기로 소포를 돌출. 염료 캡슐화를 위해, DMSO에 Dextran 텍사스 레드 스톡 솔루션 의 한 마이크로 리터와 10 밀리머 트리-HCl에 ELP 용액의 약 40 마이크로 리터를 혼합. 1부타놀 10마이크로리터를 넣고 0.25 x 25mm 바늘이 장착된 주사기를 통해 5~10회 돌출합니다.
THF 팽윤 방법은 3개의 연속단계로 구성되고 온도에 따라 ELP의 상이한 수분자 어셈블리를 초래한다. 상피 형광 현미경 이미지는 BDP-R20F20및 BDP-R40F20에서 조립된 세동 구조에서 조립된 소포를 보여줍니다. 1부타놀 압출 방법은 ELP 소포의 형성에만 이르게 한다.
THF 붓기 방법에 비해 약 2개의 크기의 더 많은 소포가 생성된다. BDP-R40F20은 10~ 15%의 부타놀과 혼합되었고, 소포는 혼합물의 압출을 통해 제조되었다. 상이한 수분자 구조는 THF 팽창 프로토콜을 통해 BDP-R40F20으로부터 조립되었다.
완충제의 pH 및 조립 공정의 온도는 동서병, 피브릴 또는 소포를 형성하도록 조정되었다. 어셈블리 프로토콜의 작은 실수는 집계의 형성으로 이어질 수 있습니다. 양전하 염료 ATTO Rho(13)와 다당류 도포(3000)는 1부타놀 압출 방법을 통해 F20R20-mEGFP에서 조립된 소포의 루멘으로 캡슐화되었다.
공초점 현미경 이미지는 녹색 채널의 소포, 빨간색 채널의 화물 및 그로 인한 병합 채널의 성공적인 캡슐화를 보여줍니다. 단일 PMBC 빌딩 블록과 조립된 PMBC 인구의 혼합 시 ELP 수륙 양용애호가의 위상 분리 및 융합 거동도 입증되었습니다. PMBC 어셈블리 이전에 혼합하면 조립된 PMBC 멤브레인 내에서 균질하게 분포된 분자로 이어지며, 조립된 소포 집단을 혼합하면 적어도 20분 동안 볼 수 있는 적색 또는 녹색 형광의 막 패치로 이어집니다.
이 절차를 시도할 때, THF 팽윤 방법과 부타놀 압출 방법 사이의 차이에 대해 올바른 단계 순서와 차이점에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라, ELP 소포는 약물 전달 셔틀, 시험관 내 전사 및 번역과 같은 효소 반응의 플랫폼으로 사용하거나 합성 최소 세포의 형성으로 사용될 수 있다.
