이 프로토콜에 설명 된 추적 기술은 우리가 신경 형태 발생을 연구하고 Drosophila의 운동 신경 시스템에서 연결을 스냅하는 데 도움이됩니다. 지포성 염료는 매우 높은 밀도로 세포막의 모든 부분에 빠르게 확산 될 수 있습니다. 이것이 우리의 프로토콜이 라벨이 붙은 뉴런의 구조를 찾기 위해 효율적으로 해결하는 이유입니다.
축 사 단자가 주입 마이크로 파이프로 접근 할 수있는 경우,이 기술은 파리의 애벌레와 성인 단계 또는 다른 유기체에 어떤 뉴런에 적용 될 수있다. 시편의 정밀한 조작을 해부하거나 사용하는 경험이 없다면 어려울 수 있습니다. 태아의 해부학을 이해, 해부 또는 주사를 수행하는 도구의 적절한 분배에 대한 지침에 도움이 될 것입니다.
시작하려면 모든 배아 수집 재료를 준비하고 배치하십시오. 50 밀리리터 튜브를 절단하고 캡에 구멍을 열어 절단하여 여과 장치를 준비합니다. 그런 다음 튜브와 캡 사이에 100 마이크로미터 모공을 가진 메쉬 필터를 설정합니다.
1.2 밀리미터의 내지름으로 동일한 모세관 튜브에서 염료 주입 마이크로 피펫 및 해부 바늘을 준비합니다. 마이크로피펫으로 튜빙을 당기고, 풀러는 170볼트 최대 출력에서 7%로 당겨 길이가 약 0.4cm의 테이퍼로 날카로운 바늘을 만듭니다. 염료 주입 마이크로피펫을 준비하려면, 습윤제로 분쇄기를 담그고 25~30도의 마이크로피펫 클램프에 바늘을 놓습니다.
그런 다음 반경의 3분의 2에 팁을 베벨링 표면의 중심에서 내립니다. 튜브가 있는 주사기가 공기를 밀어 넣는 동안 바늘을 갈아 넣습니다. 마이크로피펫을 미세 팁 영구 마커로 표시하여 각도로 형성되는 좁은 개구부를 찾는 것이 어려울 수 있기 때문에 베벨링 후 팁에서 개구부 위치를 나타내도록 한다.
파리가 실온에서 하룻밤 사이에 알을 낳고 아침에 계란으로 파이프를 수집할 수 있도록 하십시오. 배아를 수집하려면 접시에 있는 계란을 50%의 표백제로 5분간 탈염시합니다. 염화물이 지워지면 여과 장치 또는 세포 여과기를 통해 플레이트의 내용을 부어 배아를 분리합니다.
접시에 남아있는 표백제를 희석하고 필터에 혼합물을 해독하여 가능한 한 많은 배아를 수집하기 위해 물 짜기 병을 사용합니다. 표백제 냄새가 사라질 때까지 배아를 물로 3~4회 씻으시다. 장치에서 필터를 제거하고 물로 다른 깨끗한 접시에 씻어.
그런 다음 배아가 있는 새로운 판에서 물을 데수수유한다. 미세 한 집게를 사용 하 여 5 ~ 10 알 누워 후 15 시간에 배아를 선택 하 고 등쪽 측면을 향하고 있는 양면 테이프에 배치. 해부 풀에 곤충 링거 식염수식을 추가하여 배아를 탈수로부터 보호합니다.
해부 현미경의 밑에 유리 바늘을 사용하여 테이프에서 유리로 중간 막에서 배아를 끌어내어 배아의 내부 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 뒤쪽에서 전방 끝까지 표면의 단일 배아의 중간 선을 잘라냅니다. 중앙에서 상피 조직을 뒤집고 표피 가장자리를 유리 슬라이드 표면에 부착합니다.
튜브 연결 바늘에 약 300 마이크로미터의 팁 개구부를 사용하여 공기를 흡인하거나 날려 도르경계 기관 트렁크와 남은 내장을 제거하십시오. 4%의 PFA와 PBS를 사용하여 궤도 셰이커의 실온에서 5분 동안 배아를 수정합니다. 그런 다음 PBS로 세 번 씻으시기 만합니다.
항 고추냉이 과산화제 항체의 마이크로리터 1개와 함께 배아를 염색하고 Cyanine3 염료와 200 마이크로리터의 PBS를 궤도 셰이커에서 1시간 동안 접촉시. 그리고 PBS에서 세동을 반복합니다. 사출 마이크로 피펫을 채우기 위해 모세관 홀더에 넣습니다.
그런 다음 염료 슬라이드를 스테이지에 배치하고 미세 조작기를 사용하여 슬라이드 위에 배치합니다. 그런 다음 스테이지를 조정하여 마이크로 피펫을 염료에 놓습니다. 주입 압력을 200~500헤코칼로 설정하여 마이크로피펫에서 염료를 수집하고, 주입 시간은 0.1초에서 0.5초 사이이며 보상 압력을 5분 동안 0으로 설정한다.
염료를 채취하면 염료 슬라이드를 제거하고 샘플을 현미경 단계에 배치하십시오. 그런 다음 보상 압력을 30~ 60개의 혈소판 범위로 증가시키고 마이크로피펫을 시료로 낮춥춥시다. 10배의 객관적인 렌즈를 사용하여 배아를 찾고 마이크로 파이프를 배아와 정렬합니다.
목표 렌즈를 물에 침지 40회 렌즈로 변경합니다. 그리고 렌즈를 PBS에 담급합니다. 형광 현미경 검사를 사용하여 항 HRP Cy3로 표시된 신경 형태여부를 확인하고 주사 부위를 결정합니다.
배아가 초점을 맞출 때 마이크로피펫의 위치를 변경하여 축축의 끝과 부드럽게 접촉합니다. 그런 다음 주사 중에 밝은 필드 현미경 검사를 사용하여 염료 액적을 확인하십시오. DiD 또는 DiO와 함께 aCC 또는 RP3의 신경 근육 접합부에서 오른쪽 복부 중간 세그먼트에 염료를 떨어 뜨립니다.
손 컨트롤을 사용하여 염료를 방출하고 마이크로 피펫을 제거합니다. 그런 다음 다음 주입 사이트로 이동합니다. 이미징 전에 궤도 셰이커의 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.
미세 한 집게를 사용 하 여 유리 슬라이드에서 테이프를 제거 합니다. 시료를 장착하려면 4개의 모서리에 소량의 진공 그리스로 커버 슬립을 준비합니다. 조심스럽게 시료에 배치하여 기포를 피하십시오.
커버 슬립을 아래로 밀어 샘플에서 공간을 조정하여 객관적인 렌즈와 슬라이드 사이의 작업 거리를 허용합니다. 작업 와이프로 초과 PBS를 제거합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 완전히 밀봉합니다.
이미지J 소프트웨어로 공초점 현미경으로 10 배율 및 100 배율로 이미지를 처리합니다. 이 프로토콜은 ACC 모터 뉴런 내분 근육 1과 RP3 운동 뉴런 내분 근육 6 및 7 라벨을 역그레이드하는 데 사용되었다. ACC 및 RP3 모터 뉴런의 수지상 분기는 광범위한 중복을 보여줍니다.
두 뉴런은 양극성이며, 수선제의 두 가지 다른 인구를 확립합니다. 이 방법의 정량적 기능을 보여주기 위해 총 원더라이트 팁 수는 야생 유형 및 Dscam1 돌연변이체로 계산되었습니다. aCC의 입체 말단은 야생 타입에 대해 나타내지만 Dscam1 돌연변이에 대해 몇 개의 입각 형원가 관찰되었습니다.
이 절차를 시도할 때, 염료 물방울의 크기가 약 10 내지 20 마이크로미터인 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 양면 테이프의 크기를 테스트한 다음 사출 부위에 적용합니다. 이 절차를 사용하여, 우리는 플라즈마 멤브레인의 슈퍼 해상도 이미지를 얻기 위해 DiD 프로브의 사진 전환 가능한 특성을 활용할 수 있습니다.
이렇게 하면 신경 근육 접합부에서 시냅스 멤브레인의 매우 구조적 특성을 연구할 수 있습니다. 우리는 클릭을했다. 돌연변이 균주에서 aCC 원점의 표면 분석을 수행하고, Dscam1-Dock-Pak 주사가 aCC에서 원원지 아웃스승 부위를 정의한다는 것을 발견했습니다.
