이 방법은 장 내 미생물과 창자 건강 사이 상호 작용과 관련 있는 기본적인 생물학 연구 결과에 도움이 될 것입니다. 또한,이 프로토콜은 잠재적 인 프로바이오틱스와 영양학을 선별하여 새는 장 증후군 및 염증성 장 질환과 같은 장 건강 문제를 치료하는 데 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 고처리량 이미징 시스템을 사용하여 다양한 박테리아와 화학 물질로 치료된 C.elegans의 장 투과성에 대한 신속하고 정밀한 정량적 분석을 가능하게 합니다.
이 기술에 익숙하지 않은 과학자는 라벨이 잘못 된 다른 실수를 피하기 위해 샘플 수를 제한하는 것이 좋습니다. 이 절차는 웜을 96웰 플레이트로 옮기고 오페레타 머신을 사용하는 것과 하모니 소프트웨어와 같은 시각적 데모가 필요한 많은 단계로 구성됩니다. 멸균 LB 배지의 500 밀리리터를 준비하여 시작합니다.
P.aeruginosa의 단일 식민지를 매체에 접종하고 150 rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 14 ~ 15 시간 동안 문화를 배양합니다. 다음 날, 균 문화를 500 밀리리터 튜브 두 개로 고르게 분배하고, 원심분리기는 3, 220배, 섭씨 4도에서 30분간 분배합니다. 수퍼나탄을 제거하고 각 튜브에 25밀리리터를 남기고, 남은 총 부피 50밀리리터를 한 다음 세균성 펠릿을 다시 분리합니다.
사용 준비가 될 때까지 세균 문화를 섭씨 4도에 저장합니다. C.elegans의 장 투과성에 대한 박테리아의 효과를 테스트하려면 냉장고에서 배양을 제거하고 철저히 소용돌이합니다. 신선한 NGM 플레이트에 총 800마이크로리터를 추가하고 밤새 섭씨 20도의 인큐베이터에서 플레이트를 건조시다.
DIM 플레이트를 준비하려면 NGM 화약 50밀리리터를 NGM 국물을 함유한 DIM 병에 넣고 철저히 섞습니다. 그런 다음 매질의 20 밀리리터를 90-15mm 페트리 접시에 붓습니다. 각 페트리 접시에 NGM 배지가 함유된 DMSO 20 밀리리터를 첨가하여 DMSO 플레이트를 준비하고, 플레이트를 3시간 이상 실온에 두어 고화시십시오.
800 마이크로리터의 소용돌이E.coli 또는 P.aeruginosa 배양기를 각각의 신선한 NGM 플레이트에 퍼뜨리고, 플레이트가 하룻밤 사이에 섭씨 20도에서 건조할 수 있도록 합니다. 노화 동기화 된 L4 애벌레를 S 버퍼로 씻고 약 500 개의 벌레를 다른 박테리아와 화학 물질을 포함하는 NGM 플레이트로 이송하십시오. 그런 다음 48 시간 동안 섭씨 20도에서 플레이트를 배양하십시오.
FITC-dextran-보충 플레이트는 FITC-dextran 4밀리그램의 열 비활성화 된 E.coli 2 밀리리터를 혼합하여 준비하십시오. 20개의 신선한 NGM 한천 접시에 혼합물 100마이크로리터를 추가하고 깨끗한 실험실 벤치에서 1시간 동안 플레이트를 건조시다. 48시간의 치료 후, 웜을 S 버퍼로 세척하고 FITC-dextran 보충 플레이트로 옮기고 FITC-dextran없이 NGM 플레이트로 옮기고 하룻밤 동안 플레이트를 배양하십시오.
다음 날, S 버퍼로 벌레를 씻고 신선한 NGM 한천 접시에서 1 시간 동안 크롤링 할 수 있습니다. 검은 색, 96 웰, 평평한 바닥 플레이트의 각 우물에 4 %의 포름 알데히드의 50 마이크로 리터를 추가하고 각 우물에 약 50 개의 벌레를 전달합니다. 1-2분 후 포름알데히드를 모두 제거하고 각 웰에 100마이크로리터의 장착 매체를 추가합니다.
포름알데히드는 독성 화학 물질이며 주의하여 처리해야합니다. 형광 이미지를 캡처하려면 이미징 소프트웨어 내에서 열린 뚜껑 아이콘을 누르고 플레이트를 컴퓨터에 삽입합니다. 설정을 클릭하고 플레이트 유형을 선택하고 밝은 필드 및 EGFP 채널을 추가합니다.
레이아웃을 조정하려면 레이아웃 선택으로 이동하여 트랙을 선택합니다. 첫 번째 그림을 하나의 마이크로미터, 비행기 수에서 10으로 설정하고 1 마이크로미터까지의 거리를 설정합니다. 치료 우물 중 하나와 하나의 캡처 필드를 선택하고 실행 실험 섹션에서 테스트를 누릅니다.
이미지가 만족스럽으면 설정 섹션으로 돌아가 리셋 아이콘을 누릅니다. 그런 다음 모든 대상 우물과 적절한 수의 캡처 필드를 선택합니다. 실험 실행으로 이동하여 플레이트 이름을 입력하고 시작을 누릅니다.
형광 강도를 측정하려면 이미지 분석 섹션으로 이동하여 이미지를 입력하고 EGFP 채널 및 방법 B.를 선택하여 셀을 찾아 원고 방향에 따라 매개 변수를 조정하고 평균을 출력으로 선택합니다. 적용 아이콘을 눌러 설정을 저장합니다. 평가 섹션으로 이동하여 열 맵과 데이터 테이블을 얻고 판독 매개 변수를 조정한 다음 평가를 시작합니다.
C.elegans는 P.aeruginosa와 함께 잠복 후 FITC-dextran 형광이 다른 두 개의 세균균과 비교하여 상당한 증가를 보였으며, 이는 P.aeruginosa가 상피 장 장벽에 더 큰 활력을 손상시키고 장 투과성을 증가시켰음을 나타냅니다. 라이브 및 열 비활성화 P.aeruginosa 는 C.elegans에서 장 투과성에 매우 다른 효과를 트리거. 열 불활성화 시, 형광 영상과 통계 데이터는 P.aeruginosa선미에 어떤 독성을 트리거하지 않았다는 것을 나타냅니다.
DIM을 가진 48 시간 공동 처리는 P.aeruginosa에 드러낸 벌레의 창자 안쪽에 FITC-dextran 형광 강도를 현저하게 감소시켰습니다, 이는 DIM이 세균성 감염으로 인한 장 투과성 장애를 치료하는 좋은 천연 제품으로 간주될 수 있다는 것을 보여줍니다. FITC-dextran 코팅 플레이트를 준비하는 동안 FITC-dextran의 빛 감도 때문에 광 노출을 최소화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 박테리아를 테스트 하 여 장 박테리아와 그들의 활성 구성 요소의 병원 성 및 probiotic 효과 결정 하는 데 사용할 수 있습니다., 뿐만 아니라 그들의 화학 구성.
