이 프로토콜은 미생물의 돌연변이 추정을 허용합니다. 그것은 유기체가 자연 돌연변이의 확률을 환경 컨텍스트에 미치는 방법을 입증 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 저렴하고 효율적이라는 것입니다.
돌연변이 율의 많은 추정은 병렬로 만들어질 수 있습니다. 이 프로토콜 측정이 항생제에 저항을 따를 수 있는 돌연변이. 그래서이 프로토콜은 세계에서 가장 큰 도전 중 하나를 연구하는 데 사용할 수 있습니다, 항균 성 저항.
이 방법은 세포 생태학적 맥락이 항균 저항의 진화에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험실 긴장의 단배문화에서 돌연변이 비율을 추정합니다, 그러나 우리는 생물 중성 분자를 구별하기 위하여 2개의 긴장의 임상 긴장 및 공동 배양에 그것을 적용했습니다. 이 프로토콜에 사용되는 가장 위험한 반응은 항생제 리팜피신과 메탄올입니다.
그래서 리팜피신이 메탄올에 용해 될 때 보호 장갑과 고글을 사용해야합니다. 이 절차를 시작하려면 E.coli K12 글리세롤 스톡에서 얼음 조각으로 액체 리조겐성 국물의 3mL을 접종합니다. LB 문화를 120rpm에서 약 7시간 동안 섭씨 37도에서 흔들어 주세요.
그 후 식염수 용액으로 배양 2000배를 희석시하십시오. 여기에 표시된 바와 같이 각 튜브에 10mL의 액체 데이비스 최소 배지를 첨가하십시오. 희석 배양물 100마이크로리터를 50mL 스크린 캡 원내 폴리머 튜브 3개에 추가합니다.
텍스트 프로토콜의 윤곽선으로 50mL 튜브에 각각 포도당으로 5가지 액체 데이비스 최소 배지의 5가지 용액22mL을 준비합니다. 환경에 대한 접종을 준비하기 위해 먼저 600 나노미터에서 야간 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 식염수 용액으로 배양을 희석하고 각 환경에 2200에서 110000 사이의 세포를 추가합니다.
이렇게 하면 환경의 1mL에 대한 접종이 1000에서 5000 세포 사이에 포함되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 196 깊은 우물 판에 대한 병렬 문화의 임의의 레이아웃을 만들 수 있습니다. 레이아웃에 따라 접종된 매체의 1mL를 플레이트의 각 웰로 전송합니다.
그런 다음 접시 뚜껑을 테이프로 고정하고 뚜껑과 테이프로 전체 플레이트의 무게를 측정합니다. 250 rpm에서 24 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 흔들어. 그 후, 인큐베이터에 증류수 2L을 배치하여 실험 세트 중 증발량을 안정화한다.
비선택적 TA 마고 플레이트에 접종된 각 매체의 10 마이크로리터를 도금하여 접종 크기를 결정합니다. 한천 표면이 건조할 때까지 멸균 L자 형 스프레더를 사용하십시오. 그런 다음, 6개의 웰 플레이트에 리팜피신을 함유한 선택적 TA 화루를 준비한다.
선택적인 TA 마고의 파이펫 5mL은 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 들어갑니다. 비선택적 한천 플레이트에 식민지 형성 단위를 계산하고, 크기 inocula를 결정합니다. 24시간 동안 배양한 후, 전체 깊은 우물 판의 무게를 측정하여 증발량을 결정하며, 이는 분석당 무작위로 선택된 3개의 배양을 마이크로센심분리기 튜브로 옮기는 것입니다.
리팜피신을 함유한 선택적 TA 화루에 깊은 우물 판에서 나머지 81개의 평행 배양을 플레이트. 다음으로, 선택적 한천 판에서 뚜껑을 제거하고 식기 표면의 모든 액체를 건조하기 위해 멸균 조건에서 발견 됩니다. 희석 단계당 배양100 마이크로리터를 혼합하여 식염수 용액의 900 마이크로리터를 혼합하고 소용돌이시켜 5개의 10배 희석 단계를 사용하여 마이크로센심분리기 튜브로부터의 배양을 희석하여 콜로니 형성 단위의 수를 결정한다.
비선택적 TA 한고에 최종 희석제 40 마이크로리터를 플레이트하고 뚜껑을 플레이트에 놓습니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 6개의 웰 플레이트에 있는 모든 우물이 배양 액체가 없는 후 뚜껑을 다시 놓습니다.
그런 다음 44-48 시간 동안 섭씨 37도에서 뚜껑으로 접시를 배양합니다. 4일째에는 비선택적 식고 플레이트에 식민지 형성 유닛을 세어보세요. 5일째에는 선택적 TA 천 플레이트에서 항생제에 내성이 있는 콜로니수를 계산합니다.
특정 분석에 대해 관찰된 돌연변이 수의 병렬 배양 간의 분포를 기록합니다. 컴퓨터에서 적절한 소프트웨어를 엽니다. 가설 테스트 탭에서 값을 기본값에 둡니다.
관찰된 돌연변이체를 배포하여 찾아보기를 클릭하고 텍스트 파일을 선택합니다. 파일을 업로드한 후 수행된 테스트를 클릭합니다. 오른쪽에서, 테스트의 결과에서, 하나의 샘플 ML 테스트에서, 돌연변이 번호를 찾을 수 있습니다.
이것은 m, 돌연변이 이벤트의 예상 된 수입니다. 이어서, 특정 환경에서 특정 유전자형의 돌연변이율을 텍스트 프로토콜의 윤곽으로 추정한다. MG1655 돌연변이율은 3가지 상이한 표피마커, 시클로핀, 리팜피신 및 나리딕산의 돌연변이율이 여기에 도시된다.
돌연변이 율은 80 mg/L, 125 mg/L, 및 250 mg/L의 포도당 농도를 가진 데이비스 최소 배지에서 평가됩니다. 한 경우, 포도 당 농도 1000 mg/L 사용. 예상대로, 종신균 내성, 나리딕산 저항에 대한 돌연변이율이 높고, 리팜피신 저항의 비율은 중간에 있다.
변동 분석은 어떤 변형이 구성 돌연변이제이며 정상적인 돌연변이율을 갖는지 명확하게 보여줍니다. mutT 절제균은 대조군 MG1655 균주보다 약 50배 높은 나리딕산 저항에 대한 돌연변이율을 가졌다. 이 프로토콜을 미리 형성하는 동안 세포가 잘 성장하고 있는지 확인하십시오.
동일한 환경의 병렬 배양권에서 균일한 밀도로 성장해야 합니다. 이 절차에 대한 1가지 후속 조치는 저항하는 식민지에서 rpoB 유전자의 DNA 서열을 결정하는 것이다. 리팜피신 저항에 돌연변이의 스펙트럼이 환경 미생물 유전자형에 어떻게 다른지 결정하기 위해.
20 세기의 변동 적 해석은 돌연변이가 환경에 대한 존중과 함께 자발적이고 무작위인 방법을 보여 주었다. 지금, 그(것)들은 돌연변이 비율이 유전적으로, 생태학적으로, 사회적으로 어떻게 변화하는지에 새로운 빛을 흘리고 있습니다.
