يتم إصلاح الأنسجة المستخدمة في الكيمياء المناعية وعلم الأنسجة النسيجي التشخيصي بشكل روتيني في 10٪ من الفورمالين العازل للفوسفات. الكشف عن مستضد فيروس داء الكلب في أنسجة الدماغ التي تم إصلاحها في الفورماتين يمثل تحديا فريدا من نوعه، وقد وجد أن اختبار IHC هو طريقة حساسة ومحددة للكشف عن مستضد فيروس داء الكلب. الميزة الأساسية للخزعة أو طرق الكشف الأخرى هي أنه يمكن اكتشاف المستضدات فيما يتعلق بالأنسجة ومورفولوجيا الخلايا.
مع IHC، توطين مستضد داء الكلب في الدماغ والأنسجة غير المخية، وتوفير معلومات إضافية التي لا يمكن الحصول عليها من خلال أقسام روتينية Hematoxylin وEosin وصمة عار. اختبار تشخيص داء الكلب مهم لبدء الوقاية بعد التعرض في البشر المعرضين لفيروس داء الكلب. IHC هي واحدة من المقايسات الأكثر شيوعا على الأنسجة الثابتة الفورمولين.
مع أجسام مضادة محددة ، يمكن استخدامه للكشف عن مسببات الأمراض ذات الصلة. لبدء هذا الإجراء، ضع ثلاثة إلى خمسة ملليمترات من أنسجة الدماغ، التي تم جمعها بعد التشريح، في محلول فورمالين مخزن بنسبة 10٪ لمدة 24 إلى 72 ساعة. سجل وزن الأنسجة التقريبي ونوع الأنسجة وحجم الفورمالين.
ضع الأنسجة في الإيثانول 70٪ لتخزين الأنسجة لفترة أطول بعد تثبيت الفورمولين، وقبل المعالجة. بعد تثبيت العينة، قم بتشريح الأنسجة لتشمل مناطق الدماغ الهامة، مثل المقاطع العرضية من جذع الدماغ أو المخيخ أو قرن آمون. كل، وقطع إلى سمك بين ثلاثة وخمسة ملليمترات.
ضع الأنسجة في أشرطة المعالجة. معالجة أشرطة الأنسجة لتسلل شمع البارافين. تضمينها في كتل البارافين وقسمها على microtome.
قم أولا بإعداد طبق التلطيخ كما هو موضح في الشكل 1 من بروتوكول النص. ملء كل طبق مع 250 ملليلتر من الحل المعد. لإعداد AEC الركيزة الأسهم الحل، استخدم ماصة زجاجية لإذابة قرص واحد 20 ملليغرام من AEC في 5 ملليلتر من N، N-Dimethylformamide.
لإعداد محلول الأسهم بروتياز، حل 7 ملليغرام من بروتياز في 200 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. لإعداد العازلة شطف، إضافة 100 ملليلتر من توين 80 إلى 990 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، وتخلط جيدا لتشكيل حل متجانس من PBT-T. باستخدام microtome، وجعل قسم البارافين خمسة ميكرومتر.
تحميل القسم على حمام مائي في 38 درجة مئوية وجمعها على الشرائح الزجاجية. تسمية الشرائح بقلم مقاوم للكواشف. ضعي الشرائح على صينية وتذوب في الفرن على حرارة تتراوح بين 55 و60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
ثم، قم بإزالة الشرائح من الفرن وإزالة البارافينيز على الفور، وذلك باستخدام 3 شطف الزيلين متتالية من 5 دقائق لكل منهما. بعد ذلك، إعادة ترطيب المقاطع على الشريحة عن طريق الغمر المتتابع في تقليل تخفيف الإيثانول إلى الماء deionized، كما هو موضح في بروتوكول النص. علاج الشرائح مع بروتياز لمدة 30 دقيقة لاسترجاع مستضد بروتيوليك، ثم شطف الشرائح في PBS-T لمدة 10 دقائق، وعلاجها مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك، اغسل الشرائح مرة أخرى باستخدام PBS-T لمدة 10 دقائق. للبدء، قم بإزالة شريحة واحدة من المخزن المؤقت، مع التأكد من التعامل مع شريحة واحدة فقط في كل مرة، بينما تبقى الشرائح الأخرى مغمورة بالمياه، واستخدم منشفة ورقية لمسح المخزن المؤقت الزائد من حول قسم الأنسجة. ضع الشرائح في غرفة الرطوبة واحتضنها بمصل الماعز العادي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك ، احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة مع الأجسام المضادة الأولية المثلى المحددة سلفا لمكافحة داء الكلب ، والأجسام المضادة للتحكم السلبي ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة دون غسل بينهما. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مع PBS-T لمدة 10 دقائق واحتضنها في غرفة الرطوبة مع الأجسام المضادة ذات المستويات الحيوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. اغسل الشرائح مرة أخرى باستخدام PBS-T لمدة 10 دقائق.
احتضان الشرائح وغرفة الرطوبة مع تقسيم الشريط ومجمع HRB في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وغسل برنامج تلفزيوني-T لمدة 10 دقائق. ثم، احتضان مع AEC في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. غسل الشرائح في الماء deionized لمدة 10 دقائق و counterstain مع Hematoxilyn جيل، المخفف 1-2 مع الماء deionized لمدة دقيقتين.
بعد ذلك، شطف قبالة hematoxylin الزائدة عن طريق تراجع الشطف الشرائح في الماء deionized. شطف الشرائح في مياه الصنبور سكوت لمدة 30 ثانية ويغسل في الماء deionized لمدة 10 دقائق. إزالة الشرائح واحد في وقت واحد وتركيبها مع الماء للذوبان في تركيب المتوسطة.
ثم استخدم مجهر ضوئي لقراءة الشرائح. في هذه الدراسة، يتم إثبات اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس داء الكلب كاختبار تشخيصي بديل للأنسجة الثابتة بالفورملين. تظهر هنا نتيجة تلطيخ الكيمياء المناعية التمثيلية لعينات التحكم الإيجابية والسلبية في أنسجة الدماغ المختلفة ، بما في ذلك جذع الدماغ والمخيخ وخلايا البوركينجي ، وفرس النهر.
تلطيخ أحمر أرجواني، والذي يشير إلى تطور اللون باستخدام ركيزة AEC على خلفية زرقاء مضادة للملطخة، ويرجع ذلك إلى التفاعل من الأجسام المضادة ضد مستضد داء الكلب. نتيجة إيجابية في الكيمياء المناعية يتوافق مع تلطيخ أحمر أرجواني في أقسام الأنسجة. تلطيخ إدراج السيتوبلازمي وشوائب الحبيبية من حجم متفاوتة تدل على عينات إيجابية لالتهابات RABV.
وتعتبر العينات سلبية إذا لم يلاحظ تلطيخ أحمر محدد أو فقط الخلفية الزرقاء، بسبب الهيماتوكسيلين. بالإضافة إلى التلطيخ الإيجابي ، يمكن أن يوفر توزيع التضمينات قياسا كميا غير مباشر لمستويات مستضد داء الكلب في العينة ، والتي قد تتوافق مع الحمل الفيروسي لعينة الأنسجة. بغض النظر عن مستويات التوزيع، فإن أي تلطيخ محدد سيصنف العينة على أنها إيجابية للكشف عن مستضد RABV.
يجب إصلاح الأنسجة بشكل كاف في الفورملين ، وتجنب تجميد الأنسجة أثناء هذه العملية. يتم الكشف عن مستضد داء الكلب من قبل IHC ، ثم يمكن إجراء التقنيات الجزيئية على أقسام البارافين لتحديد متغير فيروس ليسا استنادا إلى معلومات تسلسل الحمض النووي الريبي. وينبغي التعامل مع الكواشف مثل الزيلين والفورمالين في أغطية الدخان.
وينبغي توخي الحذر أثناء التعامل مع AEC كما هو مادة مسرطنة.
