이 프로토콜은 약물 발견 및 개발 분야에서 특히 최소한의 부작용을 가진 새로운 일류 약물의 개발에 큰 영향을 미칩니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 GPCR 시스템에 적용될 수 있고, 실시간 생활 시스템에서 수용체 약리학에 대한 정확한 정보를 얻는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 베타 체포가 관련이 있는 새로운 치료와 밀접한 관련이 있습니다.
이들은 정신 분열증에 있는 고통 및 도파민 수용체에 있는 opiod 수용체를 포함합니다. 이 방법은 신경학에서 심장 폐 질환에 이르기까지 많은 의학 과학 연구 분야에서 유용 할 수 있습니다. 기존의 출판에서는 불가능할 프로토콜의 중요한 단계를 상세히 제시할 수 있기 때문에 우리의 방법의 PCR 데모가 중요합니다.
pBiT 벡터에 관심 있는 유전자를 소개하는 프라이머를 디자인하여 시작합니다. 다중 복제 부위를 나누는 인프레임 스톱 코돈으로 인해 방향 복제에 필요한 두 가지 고유 제한 효소 중 하나로 3개 부위 중 적어도 하나를 선택합니다. 뉴클레오티드 서열에 대한 원고를 참조하여 링커 잔류물을 인코딩하고 프라이머에 통합하십시오.
pBiT1.1-C 및 pBiT2.1-C의 경우 앞으로 프라이머에 ATG 코돈과 강력한 코작 컨센서스 시퀀스가 포함되어 있는지 확인합니다. pBiT1.1-N 및 pBiT2.1-N의 경우 역프라이머에 스톱 코돈이 포함되어 있는지 확인합니다. 관심 있는 유전자의 삽입 DNA를 증폭하기 위하여 디자인된 프라이머를 이용하십시오.
원고 방향에 따라 PCR 시약을 결합하여 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 돌연변이를 최소화하십시오. 열순환을 프로그래밍하고 반응을 시작합니다. PCR을 완료한 후 50 마이크로리터 소화 반응으로 제품을 소화합니다.
1.5 밀리리터 튜브에서 증류수 12마이크로리터, 적절한 10X 제한 소화 버퍼5개, PCR 제품의 마이크로리터 30개 등을 결합합니다. 그런 다음 각 제한 효소의 1.5 마이크로리터를 추가합니다. 반응 혼합물을 소용돌이.
그리고 하룻밤 사이에 37.5도에서 배양하십시오. 받는 사람을 소화하기 위해 두 번째 반응을 준비합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서, 물 23 마이크로리터, 적절한 10X 제한 소화 버퍼의 5 마이크로리터, 수신자 플라스미드의 15 마이크로리터, 각 제한 효소의 1.5 마이크로리터를 결합합니다.
튜브를 짧게 섞습니다. 그리고 하룻밤 사이에 37.5도에서 배양하십시오. 복제 및 변형 다음 날에, 3 ~10 개별 세균 성 식민지를 선택하고 암피실린과 LB 매체의 1 밀리리터로 전송.
6 시간 동안 세포를 배양. 그리고 암피실린을 가진 신선한 LB 매체의 5밀리리터로 세균 현탁액의 200 마이크로리터를 전송합니다. 하룻밤 사이에 200 rpm에서 흔들리면서 37.5도에서 문화를 배양하십시오.
다음 날, 플라스미드를 미니 준비 DNA 정화 키트로 분리합니다. PCR로 성공적인 결찰을 위해 정제 된 플라스미드를 선별하십시오. 트랜스펙트 하루 전에, Dulbecco의 수정 된 독수리의 매체를 사용하여 폴리 L-리신 코팅 96 웰 플레이트에 세포를 씨앗 10% 태아 소 혈청, 100 페니실린 G의 밀리리터 당 단위, 그리고 100 streptomycin의 밀리리터 당 마이크로 리터.
60개의 내부 우물에만 셀을 추가하여 플레이트 전체의 열 그라데이션 및 증발로 인한 에지 효과의 가능성을 최소화합니다. 멸균 증류수 200마이크로리터를 36개의 외부 우물에 추가하고 150마이크로리터를 우물 사이의 공간에 넣습니다. 그런 다음 하룻밤 사이에 접시를 섭씨 37.5도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
다음 날, 총 100 나노그램 DNA를 사용하여 형질 전환을 수행합니다. 원고 방향에 따라 네 가지 플라스미드 조합을 설정합니다. HEPES로 버퍼링된 수정된 Eagle의 최소 필수 매체 20마이크로리터와 잘 어울리한 1회당 0.3 마이크로리터를 사용한다.
각 웰에 20 마이크로리터의 립지딕 트랜스펙션 시약및 DNA 혼합물을 넣고 10초 동안 원을 그리며 접시를 섞습니다. 플레이트를 섭씨 37.5도, 이산화탄소 5%에서 6시간 동안 배양합니다. 매체를 새로 고칩니다.
그리고 또 다른 24 시간 동안 배양. 인큐베이션 후, 매체를 흡인하고 각 우물에 HEPES로 버퍼링 수정 된 독수리의 최소 필수 미디어의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트가 실온에서 10분 동안 안정화되도록 합니다.
한편, 100X 기판의 1부피를 LCS 희석 버퍼 19권과 결합하여, 세포 배양 배지와 혼합하는 5배 스톡을 생성하여 퓨리마진 기판을 준비한다. 세포가 준비되면 각 우물에 25 마이크로리터를 추가하고 10 초 동안 접시를 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 신호 안정화를 위해 실온에서 10 분 동안 발광을 측정합니다.
리간드 추가 실험을 위해 HEPES로 버퍼링된 수정된 Eagle의 최소 필수 미디어에 13.5X 리간드 솔루션을 준비하고 멀티채널 파이펫을 사용하여 웰당 10마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 손으로 또는 궤도 셰이커와 접시를 혼합합니다. 이 프로토콜은 프로토타입 GPCR과 두 개의 베타 체포 동소형태 간의 상호 작용을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
4개의 다른 플라스미드 조합을 선별하고, 발광 신호가 가장 높은 것을 가진 조합은 추가 실험을 위해 선택되었다. 각 베타-아테인 이소폼에 대한 EC50 값은 운동 연구에서 각 농도의 최대 반응으로부터 얻은 용량 반응 곡선을 사용하여 결정되었다. PCR 프라이머를 디자인할 때 특별한 주의를 기울이는 것이 중요합니다.
올바른 구조의 개발은 이러한 에세이의 성공에 필수적입니다. 이 방법론에 따라, 당신은 수용체 베타 - 체포 상호 작용을 모니터링 할 수있을 것입니다, 뿐만 아니라 다른 세포성 단백질과 수용체 상호 작용. 이 방법론은 GPCR 베타-아테인 상호 작용이 리간드 구조의 수정에 의해 변조 될 수있는 방법을 연구하여 GPCR 약리학 분야의 근본적인 질문에 대답하는 데 도움이 될 것입니다.
