이 프로토콜은 키트 유형, RNase R 처리, 입력 금액 및 circRNA 검출에 미치는 영향과 같은 circRNA 라이브러리 준비의 주요 측면을 평가한 결과입니다. 최적의 circRNA 검출을 가능하게 하고 사용자의 요구에 따라 조정 가능한 매개 변수에 대한 데이터를 제공합니다. 다른 견본 모형에 있는 circRNAs를 확인하는 것은 우리가 그들의 표현의 분포를 더 잘 이해하고 이 분자의 기능적인 역할을 delineating를 위한 무대를 설정하는 것을 도울 것입니다.
이 방법은 모든 총 RNA 샘플에 적용될 수 있다. 프로토콜을 시작하기 전에 RNA 샘플을 얼음 위에 유지하는 것이 중요합니다. 준비 전에 Agilent Bio analyzer 또는 TapeStation에서 RIN 및 DV200 값을 평가하고 RNA로 작업할 때 적절한 절차를 따릅니다.
RNase 가 없는 물의 39 마이크로리터에 총 RNA를 4 마이크로그램으로 희석하고 혼합하기 위해 위아래로 파이프팅하는 것으로 시작합니다. 별도의 튜브에서 1x RNase R 버퍼를 사용하여 RNase R을 마이크로리터 당 2 단위의 작동 농도로 희석하십시오. 파이펫 39 마이크로리터의 총 RNA및 10x RNase R 반응 버퍼의 5개의 마이크로리터를 1.5 마이크로리터 반응 튜브로 혼합하고 혼합한다.
희석 된 RNase R.의 6 마이크로 리터를 추가 한 다음 파이펫을 전체 반응 볼륨으로 조정하고 10 배 위아래로 파이펫을 사용하여 용액을 혼합합니다. 튜브를 섭씨 37도 의 수조에 10 분 동안 놓고 전체 반응 량이 수조에 침지되도록하십시오. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓고 RNA 정화 및 농도를 즉시 진행합니다.
시작하기 전에, 100% 에탄올의 48 밀리리터와 농축물을 혼합하여 RNA 세척 버퍼를 준비하고, 정화 컬럼을 수집 튜브에 배치한다. 준비가 되면, RNase R 처리 된 샘플에 RNA 결합 버퍼의 두 볼륨을 추가하고 잘 혼합. 총 300 마이크로리터를 혼합물에 100% 에탄올150 마이크로리터를 추가하고 전체 부피를 기둥으로 옮기고 원심분리기를 30초 간 전달합니다.
흐름을 제거하고 400 마이크로리터의 RNA 준비 버퍼를 컬럼에 직접 추가합니다. 30초 동안 원심분리기를 제거하고 흐름을 폐기합니다. 그런 다음 700 마이크로리터의 RNA 워시 버퍼를 컬럼에 넣고 30초 동안 원심분리기를 넣고 흐름을 폐기합니다.
워시 버퍼의 400 마이크로리터를 추가하면 원심분리기를 2분 간 추가하고 컬럼을 신선한 RNase 가 없는 1.5밀리리터 튜브로 옮겨 넣습니다. 기둥 필터 바로 위에 파이펫 팁을 붙이면 RNase가 없는 물 11마이크로리터를 기둥에 직접 추가하십시오. 샘플이 실온에서 1 분 동안 앉아서 원심 분리하여 1 분 동안 앉게하십시오.
1.5 밀리리터 튜브에 흐름이 있는지 확인하고 컬럼을 폐기하십시오. 정제 된 RNA 샘플은 영하 80도에서 저장하거나 도서관 준비를 위해 즉시 사용할 수 있습니다. 정제된 총 RNA의 10마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트에서 깨끗한 우물로 옮는다.
rRNA 바인딩 버퍼의 5 마이크로 리터를 추가 한 다음 rRNA 제거 믹스의 5 마이크로 리터다음 부드럽게 시약을 혼합하기 위해 위아래로 파이펫. 플레이트를 밀봉하고 사전 프로그래밍되고 예열된 열순환기 블록에서 섭씨 68도에서 5분간 인큐베이션하십시오. 인큐베이션 후, 접시가 실온에 1 분 동안 앉게하십시오.
플레이트에서 씰을 제거하고, 샘플에 소용돌이 실온 rRNA 제거 구슬의 35 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫을 45마이크로리터로 조정하고 파이펫을 10~20회 위아래로 조정하여 철저히 섞습니다. 접시가 실온에 1 분 동안 앉게하십시오.
플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮기고 1분 동안 또는 용액이 지워지도록 배양합니다. 상체를 플레이트의 새로운 우물로 옮기. 그런 다음 마그네틱 스탠드에서 플레이트 스탠드로 플레이트를 옮기합니다.
소용돌이 RNA 정화 구슬은 잘 분산 될 때까지 구슬을 청소하고 샘플에 구슬 99 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫을 위아래로 섞고 실온에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 접시를 자기 스탠드로 옮기고 5분 동안 또는 용액이 지워질 때까지 그대로 두고 우물에서 모든 상퍼를 제거하고 폐기합니다.
플레이트가 마그네틱 스탠드에 남아 있는 동안, 비드를 방해하지 않고 신선하게 준비된 80%에탄올 200마이크로리터를 우물에 넣습니다. 에탄올을 30초 동안 우물에 두고 제거하여 버립니다. 11 마이크로리터의 용출 버퍼를 웰에 넣고 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다.
플레이트를 실온에서 2분간 배양한 다음 다시 마그네틱 스탠드로 옮기고 용액이 지울 때까지 보관하십시오. 동일한 플레이트에 있는 새로운 우물에 수퍼티의 8.5 마이크로리터를 옮기고, 샘플을 포함하는 각 웰에 Elute, 프라이머, 단편 높은 믹스의 8.5 마이크로리터를 추가합니다. 파이펫을 10회 위아래로 위아래로 섞어 플레이트를 밀봉하고, 섭씨 94도로 예열된 열순환기에서 8분간 배양합니다.
샘플을 섭씨 4도로 냉각하고, 열순환기에서 플레이트를 제거하고, 원심분리기를 간단히 제거합니다. 두 개의 라이브러리 준비 키트, TruSeq와 KAPA, 이 프로토콜에 대 한 평가 되었다. 전반적으로, TruSeq 키트를 사용할 때 원형 RNA의 더 높은 수와 리보소말 RNA의 낮은 백분율이 검출되었기 때문에 TruSeq는 추가 실험을 위해 선택되었습니다.
RNase R 전처리의 중요성은 전처리 및 비처리 라이브러리에서 생성된 데이터를 비교하여 평가하였다. 예상대로, 비처리 된 라이브러리에 비해 전처리 된 라이브러리에서 더 많은 수의 원형 RNA가 일관되게 확인되었습니다. 입력 RNA의 양은 원형 RNA의 더 높은 다양성을 검출하기 위해 최적화되었다.
라이브러리는 1, 2, 4 마이크로그램의 입력 RNA를 사용하여 제조되었고, 총 RNA의 4마이크로그램을 사용할 때 원형 RNA 종의 가장 높은 다양성을 관찰하였다. 최적화된 프로토콜은 4명의 건강한 기증자에서 5개의 두뇌 지구에 있는 원형 RNA 풍부를 비교하고 6명의 건강한 기증자에게서 그밖 조직 모형을 위해 이용되었습니다. 전반적으로, 원형 RNase의 높은 풍부는 다른 조직 모형에 비해 두뇌에서 관찰되었습니다.
장갑착용, RNase 와이프 또는 스프레이로 벤치 및 파이펫을 철저히 청소하고 프로토콜을 시작하기 전에 건조시 와 파이펫을 철저히 청소하고, RNA를 사전에 얼음에 보관하는 등 RNA와 함께 작업할 때 적절한 절차를 따르는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 확인된 circRNA 접합의 Sanger 시퀀싱과 같은 직교 유효성 검사를 수행할 수 있습니다. 새로운 circRNAs의 발견과 그들의 존재의 추가 증거는 그들의 생물학 기능을 탐구하기 위한 연구의 새로운 지역을 개척합니다.
