NMR 기반 활성 작용법은 주어진 효소에 대한 억제제의 식별, 평가 및 유효성을 검사하는 효과적인 방법을 제공합니다. 그들은 특히 단편 스크리닝에 적합합니다. NMR 아세약은 약한 억제제에 필요한 더 높은 화합물 농도에 순종한다.
또한, 기자 효소의 부족은 그(것)들을 거짓 긍정에 보다 적게 수그립니다. 우리는 트리코모나스 질에서 두 효소의 억제제를 식별하고 특성화하기 위해 실험실에서 NMR 애서를 사용합니다. 두 효소모두 새로운 항-트리코모날 약물에 대한 새로운 표적을 나타냅니다.
NMR 어약은 일반적으로 효소를 관련시키는 연구의 모든 분야에 적용되며 세포 내부의 효소를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 기술의 가장 중요한 측면은 올바른 시약 볼륨이 파이펫화되고 반응 구성 요소가 철저히 혼합되도록 하는 것입니다. 기판 및 테스트 화합물을 준비하려면 4개의 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에 각각 12개의 미세리터를 추가하고 0분 제어 및 30분 제어 튜브에 6개의 미정 DMSO를 추가합니다.
시험 화합물의 6마이크로리터를 제1 실험 튜브에 추가하고 시험 화합물의 3개의 마이크로리터와 중음DMSO3마이크로리터를 제2 실험 튜브에 첨가한다. 다음으로, 300 마이크로리터의 중수소 산화물을 반응 버퍼 2.59밀리리터를 함유한 15밀리리터 튜브에 추가하고, 그 다음으로 25마이크로리터의 효소 용액을 함유하고 있습니다. 튜브를 두 번 부드럽게 반전하여 반응 스톡 용액을 혼합하고 1.5 개의 어금니 염산 10 마이크로 리터를 반응 스톡 솔루션 582 마이크로 리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 추가하십시오.
그런 다음, 반응 스톡 용액및 산의 전체 부피를 제로분 제어 튜브로 동시에 전송하여 제로분 제어 반응을 동시에 개시하고 담금질한다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡입하고 분배합니다. 나머지 3개의 반응을 비틀거리는 방식으로 시작하고 실행하여 반응 스톡 솔루션 582마이크로리터를 첫 번째 실험 튜브로 즉시 전송하고 방금 입증된 대로 샘플을 두 번 혼합합니다.
신중한 포부와 디스펜싱은 개시 단계 동안 완전한 혼합을 보장합니다. 차동 혼합이 변수가 아닌지 확인하기 위해 각 샘플과 일치하십시오. 30초 후, 반응 스톡 용액 582마이크로리터를 제2 실험관 및 혼합으로 옮기고, 제2 실험관에서 반응을 시작하고 30분 제어관에 반응 스톡 용액 582마이크로리터를 첨가하였다.
30분 후, 첫 번째 실험 관에 1.5-어금다 염산 10 마이크로리터를 추가하여 제2 실험 및 30분 제어 튜브에 대해 30초 간격으로 담금질을 반복합니다. 모든 반응이 담금질되면 각 반응에서 NMR 튜브로 600 마이크로리터의 용액을 전달합니다. 컨트롤 스펙트럼에 대한 기판의 백분율 변환을 계산하려면 샘플을 분광계에 로드하고 NMR 스펙트럼을 수집하며 0 및 30분 컨트롤에 대한 스펙트럼을 오버레이합니다.
기판 신호를 0분 제어에서 배율 조정하여 30분 제어에 일치하고 이 백분율을 기록합니다. 그런 다음 백분율 변환을 기판 신호일치에서 백분율을 뺀 백분율을 계산합니다. 시험 화합물을 포함하는 반응에 대한 기판의 백분율 변환을 계산하기 위해, 500 마이크로몰러 테스트 화합물을 포함하는 제로 분 제어 및 첫 번째 반응에 대한 스펙트럼을 오버레이하고 시험 화합물과 스펙트럼과 스펙트럼을 일치시키기 위해 제로 분 제어에서 기판 신호를 배율한다.
이 백분율을 기록하고 방금 설명한 대로 백분율 변환을 계산하는 데 사용합니다. 이어서, 250 마이크로몰러 시험 화합물을 포함하는 제로분 제어 및 제1 반응에 대한 스펙트럼을 오버레이하고, 시험 화합물과 스펙트럼에 맞게 제로 분 제어에서 기판 신호를 배율한다. 백분율을 기록한 후 백분율 변환을 계산하는 데 사용합니다.
각 시험 화합물 농도에 대한 백분율 반응 및 백분율 억제를 계산하기 위해 먼저, 대조군 시간의 백분율 변환으로 나누어 시험 화합물의 백분율 변환으로서 백분율 반응을 계산한다 100. 그런 다음 백분율 억제를 100으로 계산하여 백분율 반응을 뺀 값입니다. 세제 카운터 스크린 분석법을 수행하려면 300 마이크로리터의 산화황과 25마이크로리터의 효소 용액을 반응 완충제 2.59 밀리리터를 함유한 15밀리리터 튜브에 추가합니다.
튜브를 두 번 부드럽게 반전하여 반응 스톡 용액을 혼합하고, 트리톤 X-100 세제의 마이크로리터 2개를 반응 버퍼 20밀리리터에 추가합니다. 그런 다음 0.01%트리톤 X-100 세제를 함유한 반응 버퍼 2.59밀리리터를 새로운 15밀리리터 원내 튜브에 첨가합니다. 그런 다음 300 마이크로리터의 산화철과 25마이크로리터의 효소 용액을 튜브에 첨가합니다.
튜브를 두 번 부드럽게 반전하여 반응 스톡 솔루션을 혼합합니다. 그런 다음, 100 마이크로몰라 및 50 마이크로몰러 테스트 화합물에 대한 백분율 억제를 방금 입증한 바와 같이 결정한다. 세제 없이 반응 스톡 솔루션을 사용 하 여, 4개의 튜브의 1 세트 및 4개의 튜브의 두 번째 세트에 대 한 세제와 반응 스톡 솔루션.
점프 희석을 수행하기 위해 반응 완충제 468마이크로리터와 산화황 60마이크로리터를 53.8 마이크로리터의 반응 완충제, 5마이크로리터의 효소 용액 5개, 30분 동안 배양한 DMSO 1.2 마이크로리터를 포함하는 튜브로 이송한다. 혼합물을 두 번 흡입하고 분배하면서 느리지만 의도적인 방식으로 분배합니다. 반응 완충제 468마이크로리터와 산화중수소 60마이크로리터를 53.8 마이크로리터의 반응 완충제, 5마이크로리터의 효소 용액, 30분 동안 배양한 1.2마이크로리터를 포함하는 튜브로 이송하기 전에.
두 번째 반응을 두 번 혼합합니다. 그리고 즉시 588 마이크로리터의 용액을 점프 희석 DMSO 제어 튜브에서 혼합과 함께 12 마이크로리터의 기판을 포함하는 튜브로 이송한다. 점프 희석 시험 화합물 튜브, 희석되지 않은 DMSO 제어 튜브 및 희석되지 않은 테스트 화합물 튜브에서 588 마이크로리터를 30초 간격으로 혼합하여 튜브당 기판 12마이크로리터를 각각 3개의 1.5밀리리터 튜브로 계속 이송합니다.
그런 다음 반응을 담금질하고 NMR 스펙트럼을 수집하고 각 화합물에 대한 백분율 억제를 계산하기 전에 30 분 동안 기다립니다. 여기서 입증된 바와 같이 양성자 NMR을 이용한 초기 시험 화합물 분석에서 AgNH에 대한 2개의 화합물을 테스트한 결과가 나타난다. 효소 반응은 아데노신 싱글의 실종에 의해 가장 쉽게 관찰되고 정량화되며 각각 8.48 및 6.09 부품에서 이중 공명.
그리고 30 분 제어 스펙트럼에서 관찰된 바와 같이 백만 당 8.33 부품에서 아데닌 싱글 레지던스의 출현. 이 그림에서, 양성자 NMR을 이용한 세제 카운터스크린 분석에서 AgNH에 대한 2개의 농도에서 화합물을 시험한 결과가 입증된 바와 같이 나타났다. 기판및 제품 신호의 강도에서 관찰된 효소 억제는 화합물 응집의 아티팩트가 아니라는 것을 나타내는 최소한의 차이만이 관찰된다.
시험된 화합물및 세제에서 발생하는 공명은 기판 또는 제품 공명을 방해하지 않는다는 점에 유의하십시오. 양성자 NMR을 이용한 AGNH에 대한 점프 희석 분석에서 화합물을 테스트한 결과, 200마이크로몰라 반응에 비해 20마이크로몰라 반응에서 기판 신호의 강도가 감소되어 억제가 가역적임을 나타낸다. 각 반응을 개시하는 동안 및 점프 희석에 대한 완전한 샘플 혼합이 중요합니다.
신중하고 일관된 포부와 분배가 필요합니다. NMR 기반 의 소법은 또한 반응 완충제 및 효소 대신 에 중단된 세포를 포함하는 용액을 사용하여 전체 세포에서 효소 활성을 측정하는 데 사용될 수 있다. 우리의 항 trichomonal 약물 발견 노력은 리보 하이드로 라제 효소에 대한 새로 합성 된 화합물의 효능을 측정하기 위해 이러한 검사에 계속 의존하고 있습니다.
비록 그것은 매우 소량에서 사용, 반응을 담금질 하는 데 사용 되는 염산은 위험 하 고 적절 한 개인 보호 장비와 함께 사용 해야 합니다.
