머리와 목 부위의 암이 점점 더 널리 퍼지고 있습니다. 그러나 종양 미세 환경과 이 지역에서 치료 저항 메커니즘에 대한 제한된 이해가 있습니다. 이 기술은 접근 가능한 방식으로 머리/목 종양의 토착 미세 환경을 재구성하는 데 사용할 수 있으며 인간에서 볼 수 있는 것과 유사한 임상 증상을 생성합니다.
종양 세포 배양은 70%에 도달하면 세척당 감기 PBS로 세포를 세 번 세척하고 배양 플라스크의 바닥 표면을 덮기 위해 충분한 0.25%의 트립신으로 세포를 부착한다. 세포 배양 인큐베이터에서 3~4분 후, 광 현미경으로 분리를 확인하고 태아 소 혈청으로 보충된 DMEM F12 배지의 12밀리리터로 트립신을 중화시한다. 세포 현탁액을 50 밀리리터 원판 튜브로 옮기고 반전으로 세포를 3~4회 혼합합니다.
그런 다음 원심분리에 의해 세포를 수집하고 얼음에 대한 중간 농도의 50 마이크로리터 당 6 번째 종양 세포에 10 번 10에 혈청 및 항생제없는 DMEM에서 펠릿을 다시 중단합니다. 주입 직전에, 얼음에 지하 막 매트릭스 비율에 1 - 1 종양 세포 현탁액에 세포를 혼합. 수령동물 당 100마이크로리터의 23게이지 바늘을 장착한 0.5 밀리리터 주사기 1개를 적재한다.
주사기를 얼음 위에 놓고 마취 된 마우스에 발가락 핀치에 대한 반응이 부족한지 확인합니다. 다음으로, 5초 동안 전지 지하 막 매트릭스 현탁액의 전체 100 마이크로리터 부피의 주입을 용이하게 하기 위해 구강 내부에 있는 동안 구강 부위와 평행하게 주사기를 유지하는 입의 양쪽에 있는 사용 가능한 열린 공간을 통해 오른쪽 또는 왼쪽 buccal 영역에 바늘을 삽입한다. 주사기를 5초 동안 제자리에 두어 주사기를 부드럽게 인출하기 전에 모든 재료가 주입되었는지 확인합니다.
종양은 약 1 주일 에서 심하게 볼 수 있게 될 것입니다. 주사 후 1 주일, 캘리퍼를 사용하여 각 종양의 길이와 폭을 측정하여 일주일에 1 ~ 2 번 종양 부피를 결정합니다. 및 각 동물의 무게를 측정하여 종양 성장이 먹이에 미치는 영향을 평가합니다.
적절한 실험적 엔드포인트에서 날카로운 가위와 무딘 집게를 사용하여 목의 중간선을 통해 피부 절개를 합니다. 그리고 가위를 종양을 덮고 있는 피부 아래에 부드럽게 삽입하여 가위를 피부로 밀어 공기 주머니를 만듭니다. 일단 피부가 종양에서 충분히 분리되면, 종양 조직이 림프 조직의 존재에 의해 혼동되는 것을 피하기 위해 배수 림프절을 소비하고 전체 부피가 분리 될 때까지 종양의 경계를 통해 절단.
다운스트림 분석을 위해 종양을 처리하려면 종양을 1~2mm 크기의 조각으로 자르고 콜라게나아제 3개, DNA 1 및 트립신 억제제가 들어 있는 50밀리리터 원뿔튜브에 조각을 배치합니다. 종양 조각을 섭씨 30도에서 30분 동안 배양한 후, 10분마다 흔들리는 후, 20밀리리터의 HBSS를 튜브에 추가하고 70 마이크로미터를 통해 종양 조각을 함유한 현탁액을 70 마이크로미터 부어 나일론 스트레이너를 통과한다. 5 밀리리터 주사기 플런저를 사용하여 스트레이너의 종양 조각을 분쇄하고 여과기를 통해 HBSS의 10 밀리리터를 추가합니다.
원심분리로 세포를 회전시합니다. 엄격한 파이펫팅으로 적혈구 용해 버퍼의 2~3밀리리터에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 실온에서 2분 후 신선한 HBSS 20 밀리리터로 용액을 중화시합니다. 그런 다음 다른 원심분리를 위해 HBSS의 추가 20 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 종양 세포 현탁액에서 최종 이물질을 제거하기 위해 40 마이크로미터 부어 필터를 통해 세포를 변형시한다.
LY2 종양은 B4B8 종양에 비해 더 높은 비율로 증가합니다. 그리고 턱 변위를 나타내는 마우스는 난이증으로 인해 체중 감소를 급속히 개발합니다. LY2 마우스의 중간 생존은 또한 B4B8 종양 베어링 마우스를 위해 관찰된 반 이하입니다.
종양 을 낳는 마우스의 자기 공명 화상 진찰은 buccal 점막의 내층으로 확장하는 잘 경계한 종양을 보여줍니다, 그러나 혀 또는 그밖 가까운 기관으로. 히스토럴 검사에 따르면 모든 LY2 종양 베어링 마우스는 제대로 분화된 편평상피 세포 암이 발생하며 B4B8 종양을 가진 마우스는 적당히 분화된 편평상피 세포 암이 발생합니다. 모든 LY2 종양 베어링 마우스는 또한 조직학적으로 확인된 괴사를 가지고 있으며, 대다수는 중등도에서 중증 괴사를 입증합니다.
본 대표적인 실험에서, LY2 종양은 부칼 영역 종양 세포 주입 후 3주 후에 수확및 처리되었다. CD45 양성 면역 세포는 전체 종양 세포 집단의 7.3%를 나타냈다. CD11b 양성 골수성 세포는 모든 CD45 양성 세포의 37.8%를 나타내며, 그 중 대부분은 호중구및 골수성 유래 억제제 세포의 작은 집단과 함께 F480 양성 대식세포로 결정되었다.
T 세포는 CD45 양성 면역 세포 집단의 15.9%를 구성했으며, 그 중 53.4%는 CD4 양성 FoxP3 양성 조절 T 세포였다. 자연 킬러 세포는 모든 CD45 양성 세포의 2% 미만으로 구성되었습니다. 바늘과 받는 사람 마우스를 잡고 동물의 입을 노출에 자신감과 편안함을 개발하기 위해 주사를 연습하는 것이 중요하다.
일단 절차가 성공적으로 수행되면 종양 내성 및 미세 환경 적 요인의 치료 또는 평가에 대한 종양 반응의 평가를 포함하는 실험을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 조사자가 시작한 임상 시험을 설계하는 길을 열어 주부 암 환자에서 방사선 요법과 항 PL1 요법을 결합하는 효과를 평가했습니다.
