PIVEC는 실제 에어로졸에 세포 배양을 직접 노출할 수 있기 때문에 이 프로토콜은 중요합니다. 이 시스템은 사람이 호흡하는 것과 동일한 공기를 샘플링하도록 경고할 수 있으므로 새로운 유형의 공기 질 모니터링이 가능합니다. 이 기술의 주요 장점은 입원의 근원 또는 호흡 영역 내와 같은 벤치 탑 시스템에 접근할 수 없는 위치에서 배양된 폐 세포에 에어로졸을 포착하는 용이성입니다.
절차를 시연하는 것은 박사 린 Secondo, 내 실험실을 최근 졸업, 나다니엘 와이갈, 내 실험실에서 학부 생입니다. 이 실험의 경우 테스트 전에 24시간 동안 저장된 테스트 재료 및 제어 된 환경. 건조 분산 시스템을 조립하려면 볼 밸브를 4인치 길이의 1/8 크기의 나사 파이프의 한쪽 끝에 연결합니다.
이는 파티클 호퍼 역할을 합니다. 입자 호퍼의 열린 끝을 통해 원하는 양의 구리 나노 입자를 넣습니다. 그런 다음 다른 볼 밸브로 파티클 호퍼를 닫습니다.
2인치 길이, 1/8 크기의 파이프를 밸브에 연결합니다. 2 인치 파이프 주위에 3 인치 길이, 1/2 인치 외부 직경 튜브를 놓습니다. 짧은 튜브 내부에 HEPA 필터를 삽입하여 유동 방향이 볼 밸브를 통해 되도록 합니다.
스레딩을 사용하여 진공 발생기를 다른 볼 밸브에 연결합니다. 그런 다음 진공 발전기를 공기 탱크에 연결합니다. 진공 발전기의 출구 위에 1/4 인치 외부 직경 튜브를 넣어 실험 설정에 연결합니다.
공기 탱크의 주 밸브 및 레귤레이터 밸브를 돌려 원하는 흐름을 설정합니다. HEPA 필터에 가장 가까운 볼 밸브를 연 다음 진공 발전기에 가장 가까운 볼 밸브를 엽니다. 특성화 나 노출 중에 열어 두십시오.
먼저 진공 발생기와 가장 가까운 볼 밸브, 그리고 HEPA 필터에 가장 가까운 볼 밸브. 공기 탱크의 메인 및 레귤레이터 밸브를 닫아 흐름을 중지합니다. 정리하려면 70%에탄올을 사용하여 볼 밸브와 진공 발전기를 세척하십시오.
멸균을 위해 자동 클래브에 금속 파이프를 넣습니다. 공기 액체 인터페이스에서 세포를 배양 한 후 세포가 24 시간 동안 평형할 수 있도록하십시오. 조립하려면 PIVEC 베이스를 잘 향하게 하고 상단의 세포 배양 삽입 어댑터를 연결합니다.
마이크로 피펫을 사용하여 PIVEC의 기저에 세포 배양 배지 4 밀리리터를 추가합니다. 핀셋을 사용하여 어댑터 내에 세포 배양 인서트를 배치합니다. PIVEC 탑 피스의 좁은 부분이 위로 향하도록 어댑터에 연결합니다.
조심스럽게, 덕트 테이프의 단일 층으로 PIVEC를 포장. PIVEC의 상단과 하단에 37 밀리미터 카세트 조각을 연결하려면 밀어 넣습니다. 카세트 입구와 콘센트에 1/4 인치 가시 어댑터를 배치합니다.
PIVEC 주위에 저항 히터를 베이스에 전선으로 감쌉니다. 테이프를 고정합니다. PIVEC를 8라운드의 알루미늄 호일로 포장하여 단열재를 보관하고 테이프로 고정하십시오.
1/2 인치 외부 직경 튜브를 PIVEC 상단의 어댑터에 연결합니다. 멸균 물에서 다공성 튜브를 제거하고 PIVEC 위에 튜브 내에 배치하십시오. 시스템을 연기 후드로 옮기고 링 스탠드에 PIVEC를 고정하고 고정합니다.
에어로졸 발전기의 출구에서 직경 1/4인치 튜브를 다공성 튜브에 연결하여 페브C를 에어로졸 시스템에 연결합니다. PIVEC의 출구를 HEPA 필터에 연결된 1/4 인치 직경 튜브및 Y 커넥터로 진공 펌프에 연결합니다. 밸브를 켜고 펌프 유속을 분당 0.5리터로 설정합니다.
밸브를 닫고 펌프를 차단하기 전에 10 분 동안 구리 나노 입자에 세포를 노출합니다. 에어로졸 시스템에서 PIVEC를 제거합니다. 핀셋을 사용하여 세포 배양 삽입을 꺼내 멸균 웰 플레이트에 배치하여 원하는 생물학적 감수체를 시작합니다.
제안된 노출 시간 점을, 인서트를 이산화탄소 인큐베이터에 다시 넣습니다. 드롭퍼를 사용하여 PIVEC에서 흡인 미디어. 70%에탄올을 사용하여 PIVEC를 세척하고 다음 실험 전에 적어도 30분 동안 자외선으로 살균하십시오.
PIVEC는 증착 효율을 결정하기 위해 구리 나노 입자의 세 가지 크기를 사용하는 것이 특징입니다. 증착은 24웰 디자인, 6가지 웰 디자인에 대해 전체적으로 관찰된다. 40나노미터 및 800나노미터 구리 입자에 비해 100나노미터감소한다.
구리 나노입자 에어로졸의 입자 수 농도는 필터 기반 스캐닝 이동성 입자 시저뿐만 아니라 광학 입자 시저 측정에 의해 결정되었다. 37밀리미터 필터와 세포 배양 삽입 사이의 투여량을 결정함으로써 노출 후 분석이 신속해질 수 있다. 비교는 p 값이 0.05 미만인 800 나노미터 구리 입자에 대한 강한 상관관계를 보여줍니다.
문헌 전반에 걸쳐 체외 노출 시스템의 수직 흐름과 비교하여, 테스트된 입자 크기의 범위에 대한 PIVEC의 증착 효율은 보고된 값보다 비슷하거나 증가합니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 이 프로토콜이 실험실 환경에서 PIVEC의 사용을 입증하지만 노출 부위의 에어로졸에 대한 세포 반응을 측정하도록 설계되었습니다. 현장 테스트를 수행할 때는 테스트 에어로졸의 증착 효율을 특성화하는 것이 중요합니다.
증착 효율은 세포가 노출된 입자의 증착 된 용량을 결정합니다. 추가생물학적 검사는 노출로 인한 더 많은 세포 반응 끝점을 조사하기 위해 수행될 수 있다. PIVEC는 금속 바인더 제팅과 같은 3D 프린팅 공정 중에 생성된 에어로졸및 융합필라멘트 제조로 인한 세포 반응을 평가하는 데 사용되었습니다.
나노 입자의 사용, 특히 에어로졸 형태로, 위험 할 수 있으며, 모든 노출은 연기 후드에서 수행되어야한다. 세포 작업은 바이오 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
