이러한 절차의 목표는 형광 현미경 검사법 또는 유동 세포 분석과 결합된 특정 형광 프로브를 사용하여 정자 막 무결성을 평가하는 것입니다. 이 기술은 수정 잠재력의 예측 및 정액 견본의 질과 같은 재생산의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정자 수정 잠재력과 연관되는 것으로 알려진 여러 정자 막의 정확한 평가를 가능하게한다는 것입니다.
이러한 기술의 의미는 정자 플라즈마및 곡자 막 무결성뿐만 아니라 미토콘드리아 막 전위력에 대한 보다 정확한 평가를 가능하게 하기 때문에 사정 품질의 진단으로 확장됩니다. 이 절차를 시작하려면 실온에서 15 밀리리터 튜브에서 약 1 ~6 밀리리터의 황소 정액을 얻습니다. 6밀리리터의 NKM 버퍼를 37°C에 미리 데워서 정액 1밀리리터에 추가합니다.
원심 분리기는 8 분 동안 600 배 g에서. 상신자가 명확해질 때까지 원심 분리를 한두 번 반복합니다. 그 후, 즉시 펠릿 위에 상체의 약 1 센티미터를 떠나, 상체의 대부분을 폐기.
조심스럽게 인큐베이터에서 30도 각도로 튜브를 기대어 정자가 수영 할 수 있도록 20 ~ 30 분을 기다립니다. 마이크로 피펫을 사용하여, 조심스럽게 지금 motile 정자를 포함하는 상류체의 나머지 1 밀리리터를 제거하고 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 전송. 사용할 준비가 될 때까지 37 섭씨에서 정자를 유지합니다.
먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 모든 스톡 솔루션을 준비합니다. 다음으로, 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 밀리리터 당 2,500만 개의 정자의 농도로 운동성 정자의 133 마이크로리터를 전송합니다. DAPI 작업 용액17마이크로리터를 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.
원심 분리기는 5 분 동안 1, 000 배 g에서. 상체를 버리고 펠릿에 NKM 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로 FITC-PSA 50마이크로리터, JC-1의 마이크로리터 2개, PI 3마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 10분간 배양하세요.
원심 분리기는 5 분 동안 1, 000 배 g에서. 상체를 버리고 NKM 버퍼의 40 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 그런 다음 샘플의 마이크로리터 10을 유리 슬라이드로 옮기습니다.
샘플을 얼룩지고 커버슬립을 추가합니다. 그 후, 즉시 40X 목표와 텍스트 프로토콜에 설명된 트리플 필터로 피형현미경검사로 샘플을 시각화하기 시작하여 디지털 카메라를 사용하여 각 필터에 대해 별도의 이미지를 캡처합니다. 카메라 소프트웨어의 병합 옵션을 사용하여 필터에서 받은 세 개의 이미지를 병합하여 새 파일을 JPEG 형식으로 저장합니다.
병합된 이미지를 페인트 도구와 열고 브러시 옵션을 사용하여 계산된 정자를 표시합니다. 다음으로, 각 프로브에서 방출되는 형광에 기초하여 정자를 분류하여 슬라이드 당 적어도 200 개의 정자를 평가하십시오. 모든 셀은 DAPI에서 파란색으로 표시되어야 합니다.
보라색으로 보이는 죽은 세포를 계산하여 생존 가능성을 평가합니다. 그런 다음 형광 염색 패턴을 사용하여 곡어 상태를 평가합니다. 마지막으로, 미토콘드리아 막 전위가 높은 미토콘드리아 막 전위와 정자를 구별하여 미토콘드리아 막 전위성을 평가하여, 녹색 염색 된 중간 조각을 나타내는 낮은 미토콘드리아 막 전위와 정자에서 적색 염색 된 미드피스를 나타낸다.
빨간색과 녹색 미드피스를 따로 계산하고 비율을 계산합니다. 플라즈마 멤브레인 무결성 평가를 시작하려면 생존력 및 농도 키트에서 원하는 수의 우물을 섭취하십시오. 우물을 작업 기지로 옮기고 유연한 뚜껑으로 덮어 빛으로부터 보호합니다.
각 웰에 세포측정을 위한 버퍼링 된 용액 199 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 밀리리터당 5,700만 개의 세포농도에 균일한 정액 1개를 첨가하고 파이펫팅으로 균질화한다. 뚜껑으로 접시를 덮고 섭씨 37도에서 10분 간 배양합니다.
그런 다음 생존 가능성 설정을 사용하여 유동 사이토계를 통해 샘플을 실행합니다. 미토콘드리아 막 전위를 평가하기 시작하려면 미토콘드리아 활성 키트에서 원하는 수의 우물을 꺼내십시오. 작업 기지로 전송합니다.
각 웰에 절대 에탄올 10 마이크로리터를 추가하고 파이펫을 사용하여 우물 내에 존재하는 분말을 재보힙을 사용하십시오. 웰당 190마이크로리터의 PBS를 추가하고 파이펫팅으로 균질화합니다. 밀리리터당 5,700만 개의 세포농도에 균질성 정액의 0.75 마이크로리터를 각 우물에 추가하고 파이펫팅으로 균질화한다.
뚜껑으로 접시를 덮고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 미토콘드리아 활성 설정을 사용하여 유동 세포계를 통해 샘플을 실행한다. 곡예 막 무결성을 평가하기 시작하려면 생존력과 곡예 무결성 키트에서 원하는 수의 우물을 꺼내십시오.
우물을 작업 기지로 옮기고 유연한 뚜껑으로 덮어 빛으로부터 보호합니다. 각 웰에 사이토메트리용 버퍼링 솔루션 200마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 밀리리터당 5,700만 개의 세포농도에 균질성 정액의 0.7 마이크로리터를 각 웰에 추가하고 파이펫팅으로 균질화한다.
뚜껑으로 접시를 덮고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 인사이트 설정을 사용하여 흐름 사이토미터를 통해 샘플을 실행합니다. 이 연구에서, 정액 품질다른 기술을 사용 하 여 평가, 그 중 하나는 불소 측정 프로브를 사용 하 여 정자 막을 평가.
멤브레인 무결성 측면에서 정자 샘플 품질의 차이를 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 황소 번호 7의 사정은 죽은 세포의 상대적으로 낮은 비율, 의사 반응 곡예를 가진 정자의 낮은 비율, 그리고 황소 번호 1의 사정에 비해 더 높은 미토콘드리아 막 잠재력을 가졌다. 견본은 그 때 생존성 및 미토콘드리아 활동을 위해 평가됩니다.
이러한 대표적인 예에 대한 히스토그램은 웅덩이한 정자와 파편 및 문이 닫힌 정자를 나타냅니다. 이 히스토그램은 또한 편광 및 탈편화 미토콘드리아 막에 실행 가능한 죽은 세포및 정자의 분포를 나타냅니다. 곡어 성 무결성은 다음 즉시 사용 키트로 평가하고 흐름 세포측정으로 읽으며, 이 영역을 그대로 염색되지 않은 곡예, 낮은 형광 세포로 무시할 수 있는 낮은 형광 세포를 나타내는 세 가지 마커 영역으로 나누어, 그리고 세포가 중단된 세포와 함께 매우 형광을 가한다.
이 절차를 시도하는 동안, 제대로 초기 정자 샘플을 준비하는 것이 중요합니다. 이러한 기술은 정자 품질 평가에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 소, 가금류 및 인간과 같은 다양한 유기체에 적용 될 수 있습니다. 두 기술 사이의 비교, 네 배 염색 및 흐름 세포측정은 생존가능성에 대한 유의한 차이를 나타내지 않았다, 미토콘드리아 막 잠재력, 그리고 두 기술이 일치하는 결과를 생성 것을 밝히는 곡어 무결성.
