이 방법은 마우스 페이어의 패치 격리 T 및 B 셀 하위 집합의 표현형에 대한 주요 질문에 대답할 수 있습니다. 특히, 여포 T 도우미 및 발아 센터 B 세포 인구. 이 기술의 주요 장점은 분리 된 림프구의 품질과 정체성을 손상시키는 콜라게나아제 기반 소화와 같은 여러 가지 힘든 준비 단계를 분배한다는 것입니다.
먼저 마우스를 수핀 위치에 배치하고 70%에탄올로 복부를 살균하는 것으로 시작합니다. 복막 구멍을 열고 cecum및 ileocecal 접합을 찾기 위해 pubis에서 늑골 케이지에 피부와 복막을 통해 중간 라인 복부 절개를합니다. 작은 내장을 cecum에서 분리하기 위해 교차로에서 가능한 한 절단 할 수있는 실증을 확인합니다.
간질을 가위로 잘라 내어 소장 전체를 유실 괄약근까지 조심스럽게 제거합니다. 유두와 십이지장 사이의 접합을 잘라 내며 소장을 복강에서 완전히 분리하고 고립된 소장을 10% 태아 소 혈청 또는 FBS로 보충한 차가운 RPMI 배지를 함유한 6웰 플레이트의 한 우물에 놓습니다. 그런 다음 모든 세그먼트가 차가운 매체에 잠길 때까지 조직을 수동으로 수동으로 교반합니다.
모든 장이 수확되었을 때, 집게를 사용하여 장의 한쪽 가장자리의 막진 지방을 파악하고 샘플인 막진측을 종이 타월에 놓습니다. 조직 탈수와 끈적거림을 피하기 위해 RPMI 10%FBS로 전체 장 세그먼트를 적분시키고 창자 벽의 항 막자 측에 콜리플라워 모양의 흰색 다작으로 나타나는 Peyer의 패치를 찾습니다. Peyer의 패치를 수확하려면 곡선을 향한 곡선 수술 가위를 사용하여 각 패치를 탈구 및 근위 국경에서 부드럽게 절제하고 주변 장 조직을 배제하고 Peyer의 패치를 얼음 처럼 차가운 RPMI 10 %를 포함하는 12 웰 플레이트의 개별 우물에 배치하십시오.
모든 패치를 획득할 때 가위를 사용하여 1mm 마이크로 파이펫 팁의 끝을 잘라지므로 직경이 개별 Peyer의 패치를 흡인하고 Peyer의 패치를 37°C의 RPMI 10%의 25밀리리터를 함유한 마우스 당 150mm 원전 튜브로 전송할 수 있습니다. 그런 다음 튜브를 궤도 셰이커에 넣고 섭씨 37도에 튜브를 10분 동안 125-150 RPM에서 연속 교반합니다. 교반의 끝에서, 마우스 당 140 마이크로 미터 세포 스트레이너에 Peyer의 패치를 전송하고, 부드럽게 개별 50 밀리리터 원뿔 튜브로 메쉬를 통해 Peyer의 패치를 방해하기 위해 동물 당 하나의 10 밀리리터 주사기 플런저의 고무 끝을 사용합니다.
차가운 RPMI 10%FBS의 15-20 밀리리터로 스트레이너를 헹구고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 신중하게 슈퍼나탄을 폐기한 후, 계산을 위해 RPMI 10%FBS 농도의 밀리리터 당 약 1배 10~7세포로 세포를 재보페한다. 그런 다음 배지의 200 마이크로리터당 6세포에 2-2.5배 10회 전달하여 96웰의 둥근 바닥 플레이트와 펠릿 의 각 웰에 원심분리에 의해 세포를 전달한다.
상체를 부드러운 플릭으로 버린 후 원심분리기는 200 마이크로리터의 스탠딩 버퍼로 세포를 씻어낸다. 100 마이크로리터의 고정 생존 성 염료에 세포를 라벨링, 4섭씨에서 30 분 동안 단백질없는 버퍼로 희석, 빛으로부터 보호, 2 세차및 신선한 염색 버퍼 다음. 상체를 폐기한 후 FC 블록 20마이크로리터에서 4도에서 15분 동안 배양한 후, 1차 표면 항체 칵테일 80마이크로리터를 얼음으로 30분 간 첨가하여 빛으로부터 보호합니다.
표면 항체 배큐베이션의 끝에서 원심분리기는 세포를 과도한 부피로 두 번 세척하고, 이차 표면 염색 용액의 100 마이크로리터에서 펠릿을 재보종하여 스트렙타비딘으로 보충한다. 빛으로부터 보호되는 얼음에서 15분 후, 원심분리기는 세포를 신선한 염색 버퍼로 2회 세척하고 200마이크로리터의 고정, 투과 작업 용액으로 펠릿을 재연하여 빛으로부터 보호합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리는 즉시 플레이트를 원심분리하고, 원심분리기다음에 잘 당 200 마이크로리터에 있었다.
다음으로, FC 블록의 20 마이크로리터에서 세포를 재중단하고, 입증된 바와 같이 투과화 완충액으로 희석되고, 그 다음에는 실내 온도에서 30분 동안 관심 있는 세포 내 항체 칵테일의 80 마이크로리터를 첨가하여 빛으로부터 보호한다. 100 마이크로리터의 퍼메라블화 버퍼로 세포를 세척하고, 200마이크로리터의 투과화 버퍼에서 두 번째 세척을 한다. 이어서, 얼룩 완충제의 200 마이크로리터에서 펠릿을 재보중단하고, 튜브당 400 마이크로리터의 최종 부피로, 적절한 5 밀리리터 유동 세포 분석 튜브로 세포를 이송한다.
Peyer의 패치는 소장 전체에 고르게 분포되지 않지만 조직의 단부 및 근위 끝을 향해 더 조밀하게 국한됩니다. 이 프로토콜은 95% 이상의 세포 생존력을 가진 비장구에 대해 관찰된 것과 유사한 전방 분산 분포를 보여주는 Peyer의 패치 림프구 집단의 분리를 용이하게 합니다. CD4 CD19 이중 양성 세포는 전체 Peyer의 패치 림프구 집단의 약 1%를 구성합니다.
이러한 CXCR5 및 GL7의 높은 수준을 표현, 이는, 제외되지 않을 때, T 도우미 여포 와 발아 센터 B 세포의 게이팅에 거짓 양성 결과로 이어질 수 있습니다, 각각. 다른 이차 림프구 기관에 비해, Peyer의 패치는 안정된 상태 조건하에서 총 B 세포 집단의 2-10%의 범위에서 발아 센터 B 세포의 상당히 높은 비율을 나타낸다. 발아 센터 B 세포같이, 여포 T-도우미 세포 분획은 또한 개별 imim문화마우스에서 변화합니다, 총 10-20%의 범위, CD4 Positive Peyer의 패치 T-림프구 인구.
콜라게나아제 기반의 효소 소화는 CXCR5 T-도우미 여포 세포 발현의 대규모 감소로 이어지며 다른 표면 분자의 발현은 영향을 받지 않습니다. 이 개발 후,이 기술은 점막과 상완 면역에 관여하는 Peyer의 패치 내에서 주요 세포 요인을 식별하기위한 길을 열었습니다.
