이 방법은 정력적으로 연결된 성분을 가진 생리학적으로 실제 복합체인 과 같은 광합성 연구 분야의 특정 주요 질문에 답하는 데 유용합니까? 여기에 설명된 녹색 젤 및 TCSPC 프로토콜의 주요 장점은 빠르고 견고하다는 것입니다. 샘플을 하루 만에 쉽게 처리하고 분석할 수 있으므로 저장 및 안정성 문제가 우려되지 않습니다.
TCSPC는 우리가 여기에서 공부한 광합성 시스템에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 액체, 세포 또는 단일 분자 층 및 이온 액체와 같은 새로운 구조 적모의 형광 분자 운동의 연구와 같은 물리적 및 생물학적을 통해 화학물질에 이르기까지 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 스톡 솔루션과 녹색 미니 젤을 준비합니다. 다음으로 얼음을 얻고 조명을 어둡게 합니다.
유리 두스균균제제를 사용하여 시금치 잎을 TMK 버퍼의 약 1~2밀리리터로 완전히 균질화합니다. 간단한 필터링 장치를 만들려면 섬세한 작업을 반으로 자르고 분기로 접습니다. 주사기에서 플런저를 제거한 다음 접힌 작업을 지우기 주사기 의 바닥에 포장합니다.
파이펫 잎은 작업 닦기 필터의 중심으로 동형, 다음 필터를 통해 균모를 통과하고 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에서 수집 플런저를 사용합니다. 원심분리기는 틸라코이드 멤브레인을 포함한 불용성 물질을 10분 동안 5, 000g 및 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 상체를 버리고 TMK 버퍼의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 놓습니다.
각 샘플에서 엽록소를 추출하려면 50 마이크로리터 알리쿼트(aliquot)를 사용하여 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기습니다. 메탄올 950 마이크로리터를 넣고 튜브를 캡으로 만들고 여러 번 반전하여 섞습니다. 10, 000 g에서 10분간 원심분리기는 침전된 단백질을 펠릿합니다.
엽록소 농도 측정을 가이드로 사용하여 각 튜브에 동일한 총 엽록소양이 포함될 때까지 필요에 따라 각 샘플에서 일부 부피를 제거하고 폐기합니다. 원심분리기 5, 000g에서 10분간 틸라코이드 멤브레인을 다시 펠렛합니다. 펠릿을 방해하지 않고 모든 상체를 제거하여 제거하십시오.
먼저 TMK 30% 글리세롤 세제 용액의 알리쿼트를 해동합니다. 여러 번 반전하여 얼음에 용액을 혼합하고 유지하십시오. 펠릿을 용해하고 밀리리터당 1밀리그램의 최종 엽록소 농도를 초래하기 위해 세제 용액의 적절한 부피를 추가합니다.
샘플에서 거품을 피하기 위해 주의하면서 반복적으로 피펫위아래로 피펫. 그런 다음, 틸라코이드 샘플이 용해될 수 있도록 얼음에 샘플을 유지합니다. 용해화가 완료된 후, 10, 000g 및 4°C에서 시료를 10분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 펠릿시켜 맑고 어두운 녹색 상신화를 생성합니다.
그 후, 이전에 준비된 1.5mm 네이티브 젤의 각 웰에 직접 용해화된 틸라코이드 수퍼네티드 15마이크로리터를 적재합니다. 1X 실행 버퍼를 사용하여 100볼트에서 네이티브 그린 젤을 실행하십시오. 저항 가열을 완화하기 위해 실행 기간 동안 젖은 얼음에 전체 젤 탱크를 배치합니다.
젤이 가동을 끝나면 전기 전구에서 제거하고 증류수로 젤 플레이트의 러닝 버퍼를 헹구는 다. 젤에서 상단 플레이트를 제거한 다음 증류수로 젤을 헹구습니다. 여전히 하단 유리 판에 있는 젤을 얼음 위에 놓고 젤을 사용하지 않을 때 플라스틱 랩으로 덮고 어둠 속에서 유지하여 건조하지 않도록 하십시오.
다음으로, TCSPC 분석을 진행할 준비가 되면 날카로운 메스 나 면도날을 사용하여 각 관심 있는 대역을 소비합니다. 절제된 밴드에 오염 밴드 재료가 포함되어 있지 않은지 확인합니다. 분석되는 각 복합체에 대해 형광 분광계를 사용하여 600~800나노미터 사이의 실내 온도 형광 스펙트럼을 만듭니다.
슬라이드의 양쪽 끝에 마스킹 테이프를 놓고 여러 번 접을 수 있어 스페이서를 생성하여 슬라이드를 압축하지 않고 단단히 고정한 다음 두 개의 유리 현미경 슬라이드 사이에 젤 슬라이스를 샌드위치할 수 있습니다. 유리 슬라이드 가장자리의 젤 슬라이스에 소량의 물을 추가하여 신호 산란을 줄이는 매끄러운 인터페이스를 만듭니다. 다음으로, 빔이 플레이트의 열린 가장자리를 통해 젤 슬라이스를 공격할 수 있도록 빔 경로에 젤 샌드위치를 고정합니다.
각 복합체에 대해 형광 방출 스펙트럼에 걸쳐 일정한 간격으로 총 10, 000 개의 총 데이터 포인트를 수집합니다. 주어진 복합체에 대한 데이터를 분석하려면 먼저 수집된 모든 파장에 대해 각 붕괴 곡선의 피크 높이를 정규화한 다음, 꼬리는 각 붕괴 곡선을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 복합체의 정상 상태 형광 스펙트럼과 일치시킵니다. 녹색 젤 전기 포에이션에 대한 대표적인 결과는 맑고 날카로운 녹색 밴드의 숫자가 표시되는 시금치 틸라코이드의 분석을위한 이상적인 결과의 예를 제공합니다.
차선 2와 3은 비그라데이션 5% 아크릴아미드 젤에 간단한 틸라코이드 절연 및 전기전도에서 보다 일반적인 결과를 제시합니다. 차선 4, 5, 6은 틸라코이드 샘플의 수용성 하에서 의 증가된 정도의 증가로 인한 불량한 결과의 예를 제공하며, 7차선은 아라비도시스 틸라코이드가 시금치 대신 사용될 때 달성될 수 있는 결과를 보여줍니다. TCSPC 데이터의 데이터 곡선이 동시에 레지스터로 설정된 후 동일한 피크 높이로 정규화되어 곡선을 데이터의 첫 번째 분석으로 비교할 수 있습니다.
그런 다음 서로 다른 복합체의 피크 정규화 된 붕괴 곡선을 지정된 파장에서 서로 겹쳐서 복합체 간의 동작 차이를 시각화 할 수 있습니다. 감쇠 곡선을 일치시키는 꼬리는 부패 관련 스펙트럼을 구성할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, LHCII에 대한 부패 관련 스펙트럼은 동적 기능의 부족과 LHCII 형광 스펙트럼의 모양이 시간이 지남에 따라 신호 붕괴와 동일하게 유지된다는 점에 주목할 만하다.
형광 스펙트럼의 붕괴도 지연되어 최대 형광에 도달하기 위해 100 pico초가 필요합니다. 이것은 에너지가 형광부패로 복합체 내의 정력적으로 뚜렷한 안료 사이에서 전달되지 않는다는 것을 건의합니다. 그런 다음 붕괴 관련 스펙트럼은 Band 5 복합체에 대해 구성됩니다.
LHCII에 비해 밴드 5의 형광은 훨씬 더 빠르게 부패하여 30 pico초만에 최대 강도에 도달한 다음 500 picoseconds 후 초기 강도의 20 % 미만으로 부패합니다. 이 절차를 시도하는 동안, TCSPC 데이터의 해석은 2 DSDS 페이지와 서부 블로팅 또는 질량 분석에 의해, 예를 들어, 연구 중인 복합체의 구성 요소를 식별하는 추가 생화학 정보에 의존한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
