Diese Methode ist nützlich, um bestimmte Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Photosyntheseforschung zu beantworten, wie z. B. vermeintliche Thylakoidkomplexe physiologisch reale Komplexe mit energetisch verbundenen Komponenten? Der Hauptvorteil des hier beschriebenen grünen Gels und TCSPC-Protokolls ist, dass es schnell und robust ist. Proben können einfach an einem einzigen Tag verarbeitet und analysiert werden, was Probleme der Lagerung und Stabilität weniger bedenklich macht.
Obwohl TCSPC Einblicke in die photosynthetischen Systeme geben kann, die wir hier untersucht haben, kann es auch auf andere Systeme angewendet werden, die von chemischen bis hin zu physikalischen Systemen reichen, wie z. B. Studien zur fluoreszierenden molekularen Bewegung in Flüssigkeiten, Zellen oder neuartigen strukturellen Motiven wie monomolekularen Schichten und ionischen Flüssigkeiten. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die benötigten Bestandslösungen und grünen Minigele vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes, erhalten Sie etwas Eis und dim die Lichter.
Mit einem Glas-Dounce-Homogenisator die Spinatblätter in etwa ein bis zwei Milliliter TMK-Puffer vollständig homogenisieren. Um ein einfaches Filtergerät zu erstellen, schneiden Sie eine empfindliche Aufgabe in die Hälfte wischen und falten Sie es in Viertel. Entfernen Sie den Kolben von einer Spritze, und packen Sie dann die gefaltete Aufgabe in den Boden der Spritze wischen.
Pipette das Blatt homogenatin in die Mitte des Task-Wisch-Filters, dann verwenden Sie den Kolben, um das Homogenat durch den Filter zu passieren und sammeln Sie es in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 5.000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, um das unlösliche Material, einschließlich der Thylakoidmembranen, zu pellet. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter TMK-Puffer wieder auf.
Um Chlorophyll aus jeder Probe zu extrahieren, nehmen Sie einen 50-Mikroliter-Aliquot und geben Sie es in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 950 Mikroliter Methanol hinzu, verkappen Sie das Rohr und mischen Sie es, indem Sie es mehrmals invertieren. Zentrifugieren Sie bei 10.000 g für 10 Minuten, um die gefällten Proteine zu pellet.
Mit den Chlorophyll-Konzentrationsmessungen als Leitfaden, entfernen und entsorgen Sie einige Volumen aus jeder Probe bei Bedarf, bis jedes Rohr die gleiche Gesamtmenge an Chlorophyll enthält. Zentrifuge bei 5.000 g für 10 Minuten, um die Thylakoid-Membranen neu zu pellet. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, wobei Sie darauf achten, den gesamten Überstand zu entfernen, ohne das Pellet zu stören.
Zuerst tauen Sie eine Aliquot von TMK 30%Glycerin-Waschmittellösung auf. Mehrmals inumtieren, um die Lösung zu mischen und auf Eis zu halten. Fügen Sie ein geeignetes Volumen der Waschmittellösung hinzu, um das Pellet aufzulösen und zu einer endgültigen Chlorophyllkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu führen.
Pipette immer wieder nach oben und unten, während Sie darauf achten, Schaum in der Probe zu vermeiden. Dann halten Sie die Probe auf Eis, damit Thylakoidproben löslich sind. Nach Abschluss der Löslichkeit zentrieren Sie die Probe bei 10 000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, um das unlösliche Material zu pellet, was zu einem klaren, dunkelgrünen Überstand führt.
Danach 15 Mikroliter gelöster Thylakoid-Überstand direkt auf jeden Brunnen eines zuvor hergestellten 1,5-Millimeter-Native-Gels laden. Verwenden Sie den 1X-Laufpuffer, beginnen Sie mit der Ausführung des nativen grünen Gels bei 100 Volt. Legen Sie den gesamten Geltank für die Dauer des Laufs auf nasses Eis, um die widerstandsbeständige Erwärmung zu mildern.
Wenn das Gel fertig ist, entfernen Sie es aus der Elektrophoresezelle und spülen Sie den Laufpuffer der Gelplatten mit destilliertem Wasser ab. Entfernen Sie die obere Platte aus dem Gel und spülen Sie das Gel dann mit destilliertem Wasser ab. Legen Sie das Gel, das sich noch auf der unteren Glasplatte befindet, auf Eis; wenn das Gel nicht in Gebrauch ist, bedecken Sie es mit Plastikfolie und halten Sie es im Dunkeln, um zu verhindern, dass es austrocknet.
Als Nächstes verwenden Sie ein scharfes Skalpell oder rasiermesser, um jedes Band von Interesse zu verbrauchen, wenn sie bereit sind, mit der TCSPC-Analyse fortzufahren. Stellen Sie sicher, dass das ausgeschnittene Band kein kontaminierendes Bandmaterial enthält. Verwenden Sie für jeden zu analysierenden Komplex ein fluoreszierendes Spektrometer, um ein Raumtemperatur-Fluoreszenzspektrum zwischen 600 und 800 Nanometern zu erstellen.
Legen Sie Klebeband an beiden Enden der Dias und falten Sie es mehrmals, um Abstandshalter zu erstellen, sodass die Dias fest zusammengehalten werden können, ohne den Raum dazwischen zu komprimieren, und dann die Gelscheibe zwischen zwei Glasmikroskopie-Dias einstecken kann. Fügen Sie der Gelscheibe am Rand der Glasgleiter naden Sie eine kleine Menge Wasser hinzu, um eine glatte Schnittstelle zu schaffen, die die Signalstreuung reduziert. Als nächstes klemmen Sie das Gel-Sandwich in den Balkenweg, so dass der Strahl die Gelscheibe durch den offenen Rand der Platten trifft.
Sammeln Sie für jeden Komplex in regelmäßigen Abständen 10 000 Gesamtdatenpunkte im gesamten Fluoreszenzemissionsspektrum. Um die Daten für einen bestimmten Komplex zu analysieren, normalisieren Sie zunächst die Spitzenhöhe jeder Zerfallskurve für alle gesammelten Wellenlängen, und passen dann die Schwanzkurve dem stationären Fluoreszenzspektrum des Komplexes an, wie im Textprotokoll beschrieben. Repräsentative Ergebnisse für die grüne Gelelektrophorese sind ein Beispiel für ein ideales Ergebnis für die Analyse von Spinatthylakoiden, bei denen eine Reihe klarer, scharfer grüner Bänder sichtbar sind.
Die Bahnen 2 und 3 zeigen typischere Ergebnisse der einfachen Thylakoid-Isolierung und Elektrophorese auf einem nicht-gradienten 5%acrylamid-Gel. Die Bahnen 4, 5 und 6 sind ein Beispiel für schlechte Ergebnisse aufgrund der zunehmenden Unterlöslichkeit der Thylakoidprobe, während Spur 7 die Ergebnisse demonstriert, die erzielt werden können, wenn Arabidopsis Thylakoide anstelle von Spinat verwendet werden. Nachdem die Datenkurven der TCSPC-Daten auf das gleiche Zeitregister eingestellt wurden, können sie auf die gleiche Spitzenhöhe normalisiert werden, wodurch die Kurven als erste Analyse der Daten verglichen werden können.
Peak-normalisierte Zerfallskurven aus verschiedenen Komplexen können dann bei einer bestimmten Wellenlänge miteinander überlagert werden, so dass die Verhaltensunterschiede zwischen den Komplexen visualisiert werden können. Der Schwanz, der den Zerfallskurven entspricht, ermöglicht die Konstruktion von zerfallsassoziierten Spektren. Wie hier zu sehen, ist das zerfallsassoziierte Spektren für den LHCII durch den Mangel an dynamischen Merkmalen bemerkenswert und die Form des LHCII-Fluoreszenzspektrums bleibt die gleiche wie das Signal zerfällt im Laufe der Zeit.
Der Zerfall des Fluoreszenzspektrums verzögert sich ebenfalls, was 100 Pikosekunden erfordert, um eine maximale Fluoreszenz zu erreichen. Dies deutet darauf hin, dass Energie nicht zwischen energetisch unterschiedlichen Pigmenten innerhalb des Komplexes übertragen wird, wenn die Fluoreszenz zerfällt. Die zerfallsassoziierten Spektren werden dann für den Band 5-Komplex konstruiert.
Im Vergleich zum LHCII zerfällt die Fluoreszenz von Band 5 viel schneller und erreicht die maximale Intensität in nur 30 Pikosekunden und verfällt dann nach 500 Pikosekunden auf weniger als 20% der Anfangsintensität. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Interpretation der TCSPC-Daten auf zusätzlichen biochemischen Informationen beruhen wird, die die Komponenten der untersuchten Komplexe identifizieren, z. B. durch 2 DSDS-PAGE und Western Blotting oder Massenspektrometrie.
