Name: transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale at JoVE.com

이 작품은 노 리치 연구 공원 재학 (JR)에 의해 지원 되었다, 공동 공학 및 물리 과학 연구 위원회/Biotechnological OpenPlant 합성 생물학 연구 센터 생물 과학 연구 위원회 BBSRC 자금 부여 (BB / L014130/1) (M.J.S., ㅡ); 존이 네 스 센터 지식 교류 및 상용화 부여 (BB/KEC1740/1) (B.B.); 그리고 BBSRC 연구소 전략적 프로그램 그랜트 '자연에서 분자' (BB/P012523/1)와 존 인 스 재단 (ㅡ). 우리는 조지 Lomonossoff pEAQ 벡터를 제공 하 고 사진에 대 한 앤드류 데이비스에 게 감사 하 고 싶습니다.

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저자는 공개 없다.

넣어 통해 높은 진공 침투가이 프로토콜을을 다양 한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 관심의 보관 화합물의 대리점 생산에 대 한 우리의 실험실에서 일상적으로 사용 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 진공 침투 기구 쉽게 복제 됩니다. 그러나 진공 저수지의 추가 이다 그것은 단순히 침투 챔버로 수정 되지 않은 진공 오븐 repurpose 수 필요한 진공을 당겨 하는 데 필요한 시간을 감소 하는 것이 좋습니다. 적합 한 콘덴서의 추가 통해 진공 펌프를 보호 하는 것은 이론적으로 합리적인, 하지만 우리의 실험실에서 우리가 발견이 필요 하다.
침투 범위는 나뭇잎 침투 정지에 완전히 몰입 하지 하는 경우 손상 됩니다. 이 문제는 서 스 펜 션의 수준 공장 소유자의 상단 표면에 도달 그리고 식물 홀더 침투 목욕에 대 한 꽉 맞는 함으로써 최소화 됩니다. 때 장소에에서 침투 목욕 공장 소유자의 위쪽 표면에 중단은 그림 2 에서 참고. 이 침투 목욕의 상단으로 앵커 포인트를 형성 하는 소유자의 중간 가장자리에 패널에 의해 이루어집니다. 침투 정지 정지 수준을 유지 하기 위해 정기적으로 추가 해야 합니다. 이것은 가장 큰 batch-wise 침투의 과정을 통해 세600 의 점진적 감소를 방지 하기 위해 과잉 침투 정지의 추가 의해 달성 된다. 그러나, 우리의 손에서 물에 대 한 대체 같지 않습니다 대리점 규모, 예상된 수익률에 눈에 띄는 효과를 비록이 quantitively 조사 되지 않았습니다. 얼마나 많은 식물 침투 서 스 펜 션의 하나의 일괄 처리에서 침투 될 수 있습니다 여전히 열려있는 질문입니다. 우리는 정기적으로 침투 서 스 펜 션의 단일 일괄 처리로 100와 200 식물 사이 침투. 또한, 일부 토양 침투 과정의 과정을 통해 침투 정지로 거르는 것이 정상입니다. 이 아니라 침투 효능에 눈에 띄는 효과가 발견 되었습니다.
수확 하는 동안 그것은 권장 (하지만 중요 하지) 침투 했다 잎만 수확 (일부 잎은 성장 후 침투). 선택적 수확 비생산적인 조직, 그렇지 않으면 관심의 화합물을 기준으로 내 생 불순물의 비율을 증가 것으로 희석을 방지 합니다. 이 다운스트림 정화의 용이성에 대 한 명목상 충격이 고 이러한 프로세스의 규모를 증가 한다. THMGR를 사용 하 여 전조 공급 향상을 necrosed 표현 형 후 침투 성장 기간 동안 개발을 자주 관찰 됩니다. 이것은 정상 고 실제로 선택적 수확 및 다운스트림 건조 과정 합니다. 말린된 잎 가루는 보통 차가운, 건조 하 고, 어두운 장소에서 하지만 이상적으로 진공에서 desiccator 밀봉된 한 콘테이너에서 저장할 수 있습니다. 이 관심의 화합물의 안정성에 따라 달라 집니다. 주의-80 ° C 냉동 고에 저장을 선택 하는 경우. 되도록 건조는 오프닝 전에 실내 온도에 따뜻한이 컨테이너 허용 잎에에서 있고 방수 컨테이너, 저장소, 제거에. 이렇게 하지 않으면 다운 스트림 처리를 방해 하는 잎의 rewetting 발생 합니다.
이 프로토콜의 수확 후 단계 설명을 위해 제공 됩니다 그리고 그 연구자의 실용적인 화학 제한 할 수 있습니다 경험을 돕기 위해. 그들은 많은 다른 천연 제품 추출/정제 기술에 대 한 대체 될 수 있습니다. 그러나에 설명된대로 도입, PSE 많은 장점을, 수도의 상용 PSE 기구 비용 금지 있을 수 있습니다 있으며 중요 하지 않습니다. 기본 이온 교환 수 지 처리 액체/액체 분할 뒤 전통적인 비 누화를 대체 하는 매우 편리한 방법입니다. 그러나, carboxylic 산 그룹 또는 에스테 르 등 기본적인 조건 하에서 분해 될 것 이다 기능적인 그룹을 포함 하는 제품을 위해 적당 하다. 이 제품 기본 이온 교환 수 지에 보관 예상 될 것 이다. 그러나, 잠재적인 캡처를 위해 이것을 악용 및 릴리스 절차 (여기 설명 하지)이 있다. 전통적인 비 누화 적절 한 될 것 이라고, 기본 이온 교환 수 지 처리 편리한 대안 역할. 9, 단계에서 설명 하는 크로마토그래피 방법은 그림 3에 설명 된 화합물에 대 한 일반화할 수 발견 되었습니다. 그러나, 증가 극성의 화합물 100% 에틸 아세테이트 차입 기간이 필요할 수 있습니다. 9.2 단계에 관하여 다운스트림 잘 정화 완전히 복합 특정 이며 또한 규모에 의존. 최적화 된 그라디언트, 작은 규모 플래시 크로마토그래피의 반복된 라운드 일반적으로 NMR 분석에 대 한 적절 한 순도 달성 하기 위해 충분 하다. 큰 저울에 결정 화 자주 편리한 대안 이다. 어려운 경우, 대리점 또는 반 대리점-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 격리 화합물의 원하는 수량에 따라 사용할 수 있습니다. 대표적인 화합물의 범위에 대 한 다운스트림 정화 프로세스의 예 다른8을찾을 수 있습니다.
현재 프로토콜, 여기, 우리의 실험실에서 일상적으로 사용 되 고 유틸리티를 입증 했다. 그러나, 추가 식 플랫폼의 최적화를 위해 아직도 중요 한 범위가입니다. 작업은 얼마나 더 통로 공학 조사를 우리의 실험실에 지속적인 고 단백질 식 레벨의 차동 제어 호스트 세포 독성을 중재 하는 동안 또한, 보관 생산을 향상 시킬 수 있습니다. 또한 있다 잠재적인 세포내 수송 시스템20,21, 조작 및 다른 세포질 구획22,23, 효소 향상 시킬 수 있는 길의 방향을 조사 하 여러 산화 이벤트의 효율성입니다. 잠재적인 혜택 주요 세포의 기본 형태를 수정 하는 또한 탐험 수 있습니다. 예를 들어 애기 thaliana HMGR의 막 도메인의 overexpression 식물24; 바인딩과 그물의 비 대를 유도 하기 위해 관찰 되었습니다. CYP450 활동에 대 한 주요 사이트입니다. 이 프로토콜의 밀리 그램 그램 규모 보관 제품의 수량을 생산 것이 가장 적합 하 고 다운스트림 연구 (예를 들어, 구조 활동의 체계적인 탐사에 대 한 화합물에 액세스 하는 연구에서 채택 될 수 있다 관계, 그리고의 pharmacodynamic pharmacokinetic 속성에 예비 조사 리드 임상 관심사의 화합물). 그러나, 플랫폼은 선형 및 사용, 식물의 수 및 agroinfiltration 통해 과도 식의 실용성을 증가 하면 안정적으로 확장 가능한 입증 되었습니다 제약 단백질의 생산을 위한 산업 규모 14, 이렇게 있다 높은 값 triterpenes의 상업 생산에 대 한 확장을이 플랫폼에 대 한 가능성. 또는, 그것은 또한 최종된 욕망 multigene 생 합성 통로 들고, 대량 재배를 수 있도록 안정적인 transformants의 생산을 구상 하 고 유전자 변형 명 benthamiana 의 ' 농업' 지속적인 긴장 상업적 가치가 다른 화합물을 생산.

triterpenes는 최대 규모의 식물 천연물의 대부분 구조적으로 다양 한 가족. 그들의 엄청난 다양성에도 불구 하 고 모든 천연 제품을 보관 같은 선형 전조 2, 3-oxidosqualene, 식물에 mevalonate 통로의 제품에서에서 파생 될 여겨진다. 2, 3 oxidosqualene의 cyclization 시작 하 고 oxidosqualene cyclases (OSCs) 라고 하는 효소의 가족에 의해 제어. 이 cyclization 단계 자연1에서 보고 되었습니다 데 다른 보관 장비의 수백 다양화의 첫 번째 레벨을 나타냅니다. 이러한 건설 기계는 효소 (CYP450s)1,2포함 하 되이 제한 되지 않고, 시 토 크롬 p450s 조정에 의해 더 다변화 된다. 이러한 생 합성 경로 때로는 부모 보관에서 거의 인식할 수 있는 최종 제품의 결과로 엄청난 복잡성으로 이어질 수 있습니다. 예를 들어 강력한 살 충 용 및 antifeedant limonoid azadirachtin의 복잡 한 구조 tirucallane 유형3의 tetracyclic 보관에서 믿어진다.
많은 보관 파생 된 천연 제품, 심지어 그 상대적으로 수정 되지 않은 부모 건설 기계, 약 관련 생물 학적 활동4,5,,67을가지고 표시 되었습니다. 그러나, 지금까지이 잠재력은 하지로 번역 클리닉에서 보관 파생 약물의 과다. 이것은 틀림 없이 (적어도 부분적으로) 화합물의이 클래스에 제한 된 실용적인 합성 접근의 결과, 구조 활동 관계의 탐사 및 개발의 억압 수 있습니다 문제가 약 전통에 의해 후보자 리드 화학 워크플로입니다.
명. benthamiana 잎에 다른 식물 종에서 보관 생 합성 효소의 일시적인 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품 (그림 1)의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 이 프로세스는 기능적으로 특성화 후보 효소 자연스럽 게-발생 중요 한 대사 산물의 생 합성 경로 재구성 하 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 또한 악용 될 수 있습니다 소설 보관 제품, 구조 활동 관계의 체계적인 탐사 수 있도록 구조적으로 관련된 유사 체의 라이브러리에서 발생할 수 있는 전략 생산 조합 생 합성 접근 생물학적 활성 화합물8,9.
Agroinfiltration는 과도 식 명 benthamiana 잎에 달성의 효율적이 고 간단한 방법 이다. 프로세스는 A. tumefaciens 들고 관심의 이진 식 construct(s)의 서 스 펜 션의 침투를 포함 한다. 이 stomata, 세포 공간에 공기를 전치 하 고 A. tumefaciens 현 탁 액으로 교체를 통해 액체 압력의 응용 프로그램을 통해 달성 된다. 박테리아는 침투 잎 조직에 지역화 및 과도 단백질 표정 인 식물 세포의 내부에 각각 T-DNAs를 전송 합니다.
어떤 이진 벡터 적합 한 동안 생성 하는 유전자 변형 식물 과도 식에 대 한 고용 수 있습니다에 대 한 활용 Cowpea 모자이크 바이러스 CPMV 파생 된 Hypertranslational (HT) 단백질 표정 시스템10, 11.이 시스템에서 관심사의 유전자는 번역 되지 않은 영역 (UTR) CPMV RNA-2에서에 의해 형벌 이다. 5' UTR 수정 없이 의존 바이러스 성 복제12와 단백질 번역의 매우 높은 수준의 결과 포함 합니다. 이 기술은 복제 프로토콜 호환 구문 (pEAQ-HT-DEST)10,11사이트별 재결합을 포함 하는 쉬운 및 빠른 (pEAQ) 이진 벡터 시리즈도 개발 되었습니다. 대부분 pEAQ 벡터도는 토마토 덤 불 같은 곡예 바이러스 파생 P19 입을 억압 유전자13 circumvents 별도 P19 들고 긴장 coinfiltrate 필요 하 고 매우 월급 식 카세트의 T DNA 부분을 포함 호스트에서 고급 단백질 표정 식물 세포10,11.
명. benthamiana 의 식 호스트 장점이 특정 식물 생 합성 경로 작업할 때 사용 합니다. 셀 구조는 본질적으로 적절 한 mRNA, 단백질 처리, 및 필요한 공동 효소, (CYP450s)에 대 한 reductases 및 대사 선구자 뿐만 아니라 적절 한 구획을 지원 합니다. 탄소 소스가 이다 광합성; 따라서, 식물 입력으로만 물, CO2 (공중에서), 그리고 햇빛을 필요로 하는 좋은 품질 퇴 비에서 자란 단순히 있습니다. 플랫폼은 또한 단백질의 다른 조합의 공동 식에 대 한 매우 편리한으로이 손 쉽 세 A. tumefaciens 큰 multigene 식 구축 필요성을 negating의 다른 긴장의 공동 침투에 의해 달성 될 수 있다 카세트입니다. 또한, 과정 확장할 수 있습니다 선형 및 안정적으로 실험에 사용 되는 식물의 수를 증가 하는 것 만으로도.
우리의 실험실에 이전 작업 대리점 규모 실험을 위해이 플랫폼의 유틸리티를 시연 하고있다. 이 절연된 제품의 그램 수량을 달성 하기 위해 최대 bioactivity 분석 실험 규모에 사용 하기 위해 소설 triterpenes의 준비를 포함. 또한, 이기종 보관 제품의 축적을 증가 시킬 수 있다 몇몇 reductase (tHMGR), 속도 제한 3-hydroxy, 3-methyglutary-코엔자임의 N 터미널 잘립니다, 피드백을 구분 하지 않는 형태의 공동 식 여 접을 업스트림 mevalonate 통로8효소입니다.
키 같은 대리점 규모 실험을 편리 하 게 최대 규모 침투 과정을 기능입니다. 전형적인 실험에서 식물의 수백 수만 절연된 제품의 목표 수량 달성 하기 위해 필요할 수 있습니다. (불필요 한 주사기를 사용 하 여) 개별 잎 손으로 침투 운영 요구 하 고 종종 매우 시간이 걸리는,이 방법은 비현실적 일상적인 스케일-업에 대 한 렌더링. 연산자의 기술 수준에 종속 되지 않습니다 그것과 잎 표면의 더 중대 한 지역에의 침투를 허용 한다 진공 침투 손 침투, 이점을 제공 합니다. 이 절차는 제약 단백질14의 대규모 생산을 위해 상업적으로 사용 됩니다. 이 프로토콜 상용 부분에서 생성 될 수 있습니다 쉽게 복제할 진공 침투 기구를 이용 한다. 그러면 최대 4 식물, 시간의 짧은 기간에의 신속 하 고 실용적인 batch-wise 침투 식물의 수백을 affording의 동시 침투 (그림 2a -2b). 침투 챔버 (그림 2f)을 형성 하는 진공 오븐 진공 침투 기구에 의하여 이루어져 있다. 오븐 진공 저수지를 통해 펌프에 연결 된다. 이 크게 침투 챔버에 원하는 진공을 달성 하는 데 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. 식물에 맞춤된 홀더 확보 및 A. tumefaciens 현 탁 액으로 가득 10 L 스테인리스 물 목욕으로 거꾸로 (그림 2a -2 c). 완전 한 침수 식물의 공중 부분의 효율적인 침투에 대 한 중요 하다. 물 목욕 챔버 내에 침투 배치 됩니다 (그림 2d -2e), 및 잎 중간 공간에서 공기를 그릴에 적용 하는 진공. 일단 압력 880 mbar (프로세스는 약 1 분 소요)으로 단축 되었습니다 침투 챔버는 들어온 신속 하 게 다시 대기압에 침투 완료 되 면 위에 오븐 입구 밸브를 개방 하 여 20-30 s.
침투 후 5 일 식물 재료는 수확 하 고 후속 추출 및 원하는 제품의 절연에 대 한 준비. 이 시점에서 과정은 단순히 자연 제품 추출 및 잎 소재, 모든 자연 제품 화학자에 익숙한 워크플로에서 정화의 하나. 초기 추출 및 후속 정화에 대 한 여러 가지 방법15를존재 한다. 방법 및 정확한 조건 사용의 가장 적절 한 선택 높은 관심, 능력 및 장비의 가용성 뿐만 아니라 화합물의 특정 화학 속성에 따라 달라 집니다. 그것은 관심, 보관 제품에 대 한 맹목적으로 따라 할 수 있는 절연된 제품에 수확된 식물 잎 재료의 다운스트림 처리에 대 한 완벽 하 게 받아들이기는, 단계별 방법이이 프로토콜에 포함 될 수도 있을 것 이라고 그렇게 하려고 하는 것 적절 한. 그러나,이 프로토콜은 우리의 실험실에 있는 우리의 경험에서 가장 산소 aglycone 보관 제품 받아들이기는 입증 과정의 초기 단계에 대 한 몇 가지 방법을 사용 하는 기본 워크플로 대 한 개요를 제공 합니다. 2 비교적 드문 기술, 즉, 가압 용 매 추출 (PSE) 및 강하게 기본적인 이온 교환 수 지를 사용 하 여 엽록소 제거에 대 한 편리한 이기종 단계 방법 포함 됩니다.
PSE 고체 행렬에서 작은 유기 분자의 추출에 대 한 매우 효율적인 기술입니다. 추출 압력 (ca. 100-200 bar)에서 수행 됩니다, 그리고 끓는 초과 하는 의료진된 온도 사용 하 되 주요 장점은 추출 용 매에의 합니다. 이 크게 시간과 간단한 환류 등 Soxhlet 추출16다른 뜨거운 용 매 기술에 비교 될 때 완전 한 추출, 달성 하는 데 필요한 용 매의 양을 줄일 수 있습니다. 상업적인 벤치탑 PSE 악기는 상호 추출 셀 및 자동된 용 매 처리, 난방, 그리고 모니터링을 활용 수, 있습니다. 이것은이 기술을 매우 편리 합니다. 그것은 또한 틀림 없이 덜 위험, 특히 제한 된 실용적인 화학 경험을 가진 사업자에 대 한입니다.
비 누화 퇴조 액체/액체 분할 뒤에서 원유 잎 추출 물의 후속 정화 또는 분석 전에 chlorophylls의 대량 제거를 위한 일반적인 기술입니다. 그러나,이 수 자주 될 운영 체제 요구 더 큰 가늠 자에. 또한, 인터페이스, 또는 유화 액의 형성으로 인 한 제품 손실의 문제가 될 수 있습니다. 이기종 단계 가수분해 수행을 강하게 기본적인 이온 교환 수 지를 사용 하 여 편리한 대안이 될 수 있습니다. 분해 된 엽록소의 색소 부분 수 지에 준수 남아 있고 단순히 여과 의해 제거 될 수 있다. 이 프로토콜의 상용 기본 이온 교환 수 지를 사용 하는 이전에 보고 된 분석 절차17 대리점 규모 적응을 활용 합니다.
아래는 triterpenes 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 대리점 규모 생산에 대 한 상세 하 고 빠른 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 사용 정기적으로 우리의 실험실에 격리 보관 제품의 밀리 그램의 수백 수만 응용 프로그램에 대 한 구조적 특성화 하 여 준비 핵 자기 공명 (NMR) 분광학, 추가 기능에서 공부 하 분석 실험입니다.

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/&gt; 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/&gt; 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&amp;reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;5&amp;rsquo;-dimethoxy-4&amp;rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&amp;reg;&amp;nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Supplier New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vector</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>any reputable supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale

triterpenes는 최대 규모의 식물 천연물의 대부분 구조적으로 다양 한 가족. 많은 보관 파생 상품 약 관련 생물 활성을가지고 표시 되었습니다. 그러나, 지금까지이 잠재력은 하지로 번역 클리닉에서 보관 파생 약물의 과다. 이것은 틀림 없이 (적어도 부분적으로) 화합물의이 클래스에 제한 된 실용적인 합성 접근의 결과, 구조 활동 관계의 탐사 및 개발의 억압 수 있습니다 문제가 약 전통에 의해 후보자 리드 화학 워크플로입니다. 그들의 엄청난 다양성에도 불구 하 고 triterpenes 모두에서 파생 된 단일 선형 전조, 2, 3-oxidosqualene. 명. benthamiana 에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식에는 자연스럽 게이 호스트에 의해 생산 되지 않습니다 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로 2, 3 oxidosqualene의 생 공급 착륙 장이 있습니다. 농업-침투는 북 아 일 benthamiana에 과도 식 달성의 효율적이 고 간단한 방법 이다. 프로세스는 Agrobacterium tumefaciens 관심의 식 construct(s) 운반의 현 탁 액으로 식물 잎의 침투를 포함 한다. 추가 A. tumefaciens 의 공동 침투 변형 생성 효소 선구자 공급을 크게 향상 증가 인코딩 식 구문 들고. 5 일의 기간 후 침투 잎 재료는 수확 고 추출 하 고 결과 보관 제품을 분리 처리 될 수 있습니다. 이 실험에 사용 되는 식물의 수를 증가 하는 것 만으로도 선형 및 안정적으로 확장 되는 프로세스입니다. 여기는 triterpenes 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 빠른 대리점 규모 생산을 위한 프로토콜을 설명. 프로토콜 활용 쉽게 복제할 진공 침투 기구, 시간의 짧은 기간에 식물의 수백의 batch-wise 침투 수 있도록 최대 4 개까지 식물의 동시 침투를 허용 합니다.

일반적인 격리 된 수익률 조사, 대상 화합물의 화학 안정성 및 어떻게 했다 도전 정화 과정에서 효소/효소 조합에 따라 달라 집니다. 우리는 이전 β-amyrin의 고립 된 수익률을 보고 3.87 mg의 그램 당 0.12에서까지 우리의 조합 생 합성 실험에서 파생 상품 명. benthamiana 잎 분말 건조. 이러한 화합물의 산화의 수준에 넓게 배열 하 고 부자연 스러운 조합의 효소 (그림 3)8포함. 이 프로토콜이 사용 됩니다 정기적으로 우리의 실험실에 수십 또는 수백 밀리 그램 구조 특성에 대 한 정제 제품의 생산을 NMR 분광학 및 하류 기능 분석 실험. 우리도 보관 비 β-amyrin에서 98% 이상의 순도의 0.8 g을 생산 하 여이 플랫폼의 대리점 유틸리티 시연 했다. 이 실험은 459 식물을 사용 하 고 드라이의 그램 당 3.3 m g의 고립 된 수익률을 나타냅니다 명. benthamiana 잎 분말8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> 그림 1: 도식 요약. 새로운 고부가가치 보관 제품의 대리점 생산으로 2, 3 oxidosqualene의 생 공급을 다른 곳으로 명. benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 식 악용 하는 프로세스의 도식 적인 표현입니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> 그림 2: 진공 infiltrator 건설과 과정.는) 공장 소유자 한 날개 분리 맞춤 b) 서비스 공장 홀더 날개 부착. c) 역전과 식물의 침수. d) 침투 목욕의 삽입. e) 침투 침투 챔버 내에 목욕. f) 완전 한 진공 infiltrator: (1) 진공 펌프 진공 펌프 진공 저수지 (3) 진공 저수지 격리 밸브 진공 저수지와 침투 챔버 (5) 압력 게이지 (6) 공기 흡입구 밸브 (7) (4) 연결에서에서 연결 (2) 침투 챔버 (8) 진공 저수지 g) 대표는 5 일 후 침투 성장 후 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대 한 식 구문을 함께 침투 한 공장에서 출발 한다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> 그림 3:8이 프로토콜 사용 하 여 β-amyrin 파생 상품의 대리점 생산에 대 한 대표적인 결과 이전 보고. 이 테이블은 고립 된 수익률으로 정렬 됩니다. 열 조건에 따라 상대적인 값의 색상 표시로 포맷 됩니다. 레드 그린 = 높은, 낮은 (비록 중간 노란색) =. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

Nicotiana benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 여기는 triterpenes 그리고이 강력한 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 아날로그의 빠른 (5 일) 대리점 규모 생산을 위한 상세한 프로토콜을 설명.

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

17.2K 조회수.  John Innes Centre. Nicotiana benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 여기는 triterpenes 그리고이 강력한 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 아날로그의 빠른 (5 일) 대리점 규모 생산을 위한 상세한 프로토콜을 설명.

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

연구

환경과학

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

재조합 셀룰라아제 Cel5A의 표현에서<em&gt; 트리코더마 reesei</em&gt; 담배 식물에서

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

사례 연구로 담배에 과도 단백질 발현 : 실험 접근의 디자인을 사용하여 복잡한 시스템의 특성

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

생체공학

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

생화학

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

생물학

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

N. benthamiana 잎에서 GFP-His의 효율적인 추출 및 정제

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

저자 스포트라이트: 식물 세포에서 재조합 단백질의 효율적인 회수를 위한 Apoplast 단백질 추출 최적화

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

식물에서 생산된 재조합 단백질의 순도를 향상시키기 위한 Apoplast-extraction 기반 방법  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

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