Name: luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
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이 작품은 자연 과학 재단의 장쑤 성 (BK20140919), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31470375), 우선 교육 프로그램 개발의 장쑤 등 교육 기관 및 청 Lan 프로젝트에 의해 지원 되었다.

1. 식물 (8 주)의 준비
<ol><li>5% NaClO 0.1% 트라이 톤 X-100 (V/V) 솔루션 및 두고 씨앗 소독을 5 분의 1 mL를 포함 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 50 Nicotiana benthamiana 씨앗을 넣어.</li>
	<li>5 번 살 균 물으로 종자를 헹 굴 하 고 살 균 물 200 µ L에서 씨앗을 일시 중단.</li>
	<li>신중 하 게 장소 개별 씨앗 MS-한 천 매체 (1 l: 重 & Skoog 소금 10 g 자당, pH 5.8 x 1 (코), 1 %agar) 좋은 팁 및 발 아 동기화를 3 일 동안 4 ° C에 게 중간 접시의 표면에. 참고: 미생물 오염을 방지 하려면 클린 벤치에이 단계를 수행 합니다. 살 균 동안 튜브를 흔들 필요는 없습니다.</li>
	<li>10 일 동안, 정상적인 성장 조건 (22 ° C, 80-90 µmolm-2의-1 흰 빛의 강도)에서 중간 접시 놓고 토양으로 세균된 묘를 전송 합니다. 참고: 토양에 모 종 뿌리를 삽입 하 고 뿌리를 손상 하지 마십시오. 투명 한 플라스틱 커버와 하룻밤 습도 유지 하기 위해 트레이 커버.</li>
	<li>16 h/8 h 명암 주기 및 70% 습도에 제어 성장 방에 식물을 성장 한다. 7 주 된 명. benthamiana 식물 Agrobacteriumtumefaciens 침투 (그림 1A)에 대 한 준비가 되었습니다. 참고: 식물을 급수 하 고 식물의 건강을 유지 하는 데 필요한 해충을 제어.</li>
</ol>2. 과도 식 명 Benthamiana 잎 (7-10 일)
<ol><li>플라스 미드의 배달 150 ng (pEGAD-하-뤽 제어 플라스 미드, 빈 벡터 및 국제 협회에 대 한 생성 된 플라스 미드 분석 결과,이 경우에 우리가 사용 pCAMBIA1300 Nluc 및 pCAMBIA1300 Cluc 플라스 미드 건설) A. tumefaciens 유능한 세포로 변형으로 GV3101는 표준 electroporation 방법입니다.</li>
	<li>Luria Bertani (파운드) 한 천 매체 (1 l: 10 g NaCl, 5 g 효 모 추출 물, 10 g tryptone 1.5 %agar) 포함 50 µ g/mL 대와 4 일 동안 28 ° C에서 리 팜 피신의 50 µ g/mL에 문화 A. tumefaciens 참고: 벡터 및 사용 A. tumefaciens 변형에 따라 항생제의 선택 합니다.</li>
	<li>접종 한 파운드 50 µ g/mL 대과 리 팜 피신의 50 µ g/mL를 포함 하는 액체 매체의 3 mL에 각 접시에서 A. tumefaciens 식민지를 단일 및 24 h 셀 문화 전파를 위한 28 ° C에서 220 rpm에 흔들.</li>
	<li>15 mL 신선한 파운드 액체 매체 포함 된 50 µ g/mL 대과 리 팜 피신, 200 배 희석의 50 µ g/mL로 75 µ L 세균성 문화를 전송 합니다. OD600 0.5에서 1.0 사이 때까지 약 8 시간, 30 ° C에서 220 rpm에서 박테리아를 문화.</li>
	<li>A. tumefaciens 액체 문화 15 mL 원심 분리기 튜브에 전송 하 고 4000 x g와 15 분 삭제는 상쾌한 4 ° C 원심 펠 릿을 세척 하 변환 솔루션의 15 mL에 펠 릿을 중단.</li>
	<li>4000 x g와 15 분 동안 4 ° C 튜브를 회전 하 고는 상쾌한 삭제. 다시 한 번 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>변환 솔루션의 5 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 실 온에서 2 h 동안 유지. OD600 의 최종 농도 0.5, 또는 테스트 쌍을 이루는 단백질 상호 작용에 대 한 동등한 양으로 혼합 두 샘플까지 변환 솔루션 A. tumefaciens 펠 릿 셀의 밀도 조정 합니다.</li>
	<li>7 4번째 에 침투 중단 셀일 단풍 1 mL needleless 주사 통 (그림 1B-C). 침투 후 검은색 플라스틱 커버와 함께 즉시 식물을 커버 하 고 12 h에 대 한 어둠 속에서 트레이 놓습니다. 그 후, 평소 뤽 활동을 검출 하기 전에 2 ~ 4 일에 대 한 식물을 성장. 참고: 비슷한 크기의 건강 한 잎을 선택 합니다. 한 잎에 4 개의 다른 영역의 침투는 괜 찮 아 요.</li>
</ol>3. 감지 Luciferase 활동 (1 일)
참고: luciferase 활동을 모니터링 하는 두 가지 방법이 있다. 하나는 이미징, 기반 그리고 다른 양적 luciferase 활동을 측정 하는 것입니다.
<ol><li>
이미징 방법
	<ol>
<li>침투 잎을 분리 하 고 MS-한 천 매체에 전체 전단지를 넣어.</li>
		<li>스프레이 50 mL 스프레이 용기와 표면에 잎 adaxial 소 작업 버퍼입니다. 엽록소 자동 형광 담금질 하기 위해 5 분 동안 어둠 속에서 자료를 유지.</li>
		<li>이미지 (그림 2)를 (-30 ° C에 냉각) 장치 이미징 낮은 조명 냉각된 CCD를 사용 합니다. 빛에 신청 노출 시간이 50 밀리초 이며 발광 검출 시간은 1 분입니다. 참고: 컴퓨터 매뉴얼에 따라 매개 변수를 조정 합니다. 낮은 온도 이미지 품질을 향상 시키기 위해 신호-잡음 비율을 강화할 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는, 상업적인 루미 노와 직접 발광을 측정 합니다.<ol>
<li>조심 스럽게 명. benthamiana 잎의 침투 지역에서 (약 0.25 cm2) 잎 조각을 잘라 고 잎 디스크 100 µ L 96 잘 흰 접시 (그림 3)에서 이온 물에 담가.</li>
		<li>소 작업 버퍼의 10 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 둡니다. 그런 다음 특정 치료 단백질 상호 작용 역학 연구를 수행 합니다. 참고: 특정 치료에서 단백질 단백질 상호 작용의 활동을 나타내는 luciferase 활동 역학을 얻을 다른 시간 지점에서 루미 노와 발광을 감지 합니다. 이 메서드는 동시에 많은 수의 단백질 쌍을 테스트에 대 한 이점이 있다. 서쪽 오 점 여 luciferase 단백질 나타났는데 검사 그 상업 루미 노 하지 않고, 따라서 뤽 활동 quantitively를 참조 하십시오. 빛이 반드시 필요한 경우 단지는 루미 노에 접시를 유지 하 고 다른 시간 지점에서 발광을 측정. 그렇지 않으면 검출 간격 동안 성장 챔버에 접시를 이동 합니다. 적어도 3 개의 생물 복제를 사용 하 여 통계적으로 유의 한 결과 얻을. 루크 활동 다른 침투 영역에서 달라 지기는 하지만 그들의 변화 패턴 일치 하는 정규화 후입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF(COI1)+complex+during+jasmonate+signalling.">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li><li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling.">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li><li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis.">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li><li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays.">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants.">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis.">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li><li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+repression+of+photomorphogenesis:+role+switching+of+COP/DET/FUS+in+light+signaling.">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li><li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light.">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li><li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism.">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li><li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis.">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 프로토콜은 간단 하 고 vivo에서 단백질-단백질 상호 작용, 공부에 대 한 재현 고 외 인 치료에서 단백질 상호 작용 역동성을 감지 하는 데 특히 적합. 이 분석 결과 주요 단계 명. benthamiana 침투입니다. 성공을 보장 하기 위해 침투, 식물 매우 건강 해야 합니다. 또 다른 중요 한 요인은 침투 후 luciferase 활동을 확인 하는 시기입니다. 이 질문에 대 한 정확한 대답이 있다. ?...

환경과 성장 조정 하려면 식물 감각, transduce, 신호 신호에 응답 하는 우아한 신호 경로 진화해왔다. 릴레이 경주에서 주자 처럼 단백질은 식물 신호 변환에 필요한 선수. 그것은 널리 인정 되었습니다 단백질 단백질 상호 작용 (PPI) 셀룰러 통신에 대 한 주요 역할을 한다. 단백질 인 산화, acetylation, 및 저하 모두 대상 단백질 및 그것의 수정 효소 간의 실제 상호 작용에 따라 달라 집니다. 예를 들어 Jasmonate ZIM 도메인 단백질 (JAZ) 가족 단백질 녹음 방송 요인 MYC2와 상호 작용 하 고는 transcriptional 활동1,2를 억제. PPI의 중요성을 감안할 때 대규모 단백질 interactomes 식물에 되었습니다 탐험 최근3,,45. 이러한 위하여 결과 더 다양 한 세포 기능을 조정 하는 복잡 한 규제 네트워크 공개.
PPI를 모니터링 하기 위한 몇 가지 설립된 접근이 있다. 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과 PPI 탐지에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법입니다. Y2H를 수행 하기 쉽고 단백질 상호 작용을 검사 하는 빠른 테스트를 위해 적당 한 이다. Y2H는 관심의 특정 단백질에 대 한 알 수 없는 상호 파트너 심사 또한 널리 이용 된다. 그러나, Y2H은 효 모에 전적으로 실시 하기 때문에 그것은 수 없습니다 반영 공장에서 실제 시나리오 세포 높은 거짓 긍정적인 요금을 가져온다. 또 다른 유사한 전략은 풀 다운 분석 결과 이다. 일반적으로, 두 단백질은 표현 및 대장균 세포에서 정화와 혼합 그리고 단백질 상호 작용 검출을 위한 움직일 수 있습니다. 이 방법은 시간이 오래 걸릴 하지 않습니다, 비록 그것은 얻을 수 없습니다 vivo에서 상호 작용 결과 중 하나. 목적을 위해 비보에 상호 작용, 공동-immunoprecipitation (공동-IP) 고품질 immunoprecipitate 관심의 단백질에 항 체를 요구 하 고 간접 PPIs의 가능성을 제외 수는 가장 인기 있는 분석 결과 이다. 또한, 공동-IP에 복잡 한 실험 절차 때문 결과 일반적으로 개별 전문성을 갖춘 다.
기자 기반으로 재구성 분석 실험은 크게 vivo에서 PPI의 탐지 사전. 이러한 방법에는 형광 공명 에너지 전달 (무서 워)6, 분자 형광 보완성 (BiFC)7및 이미징 (협회) 분석 결과8반딧불 luciferase 보완성 포함 됩니다. 있지만 이러한 세 가지 방법 공동 IP 보다는 직접 vivo에 맞게 PPI, 무서 워, BiFC 특정 현미경 형광 신호 필요와 쉽게 상호 작용 강도 정할 수 없습니다. 반면, 협회의 기판 소 반응 후 놀 것 이다 반딧불 luciferase의 활용. 더 중요 한 것은, PPI 강도 luciferase 활동의 값에서 확인할 수 있습니다. 따라서, 협회는 뿐만 아니라 두 단백질 상호 작용, 하지만 또한 치료 시 상호 작용 역동성에 정보를 제공 합니다 여부를 나타냅니다. 비록 몇 가지 설정된 방법이 상호 역학 (표면 플라스몬 공명 또는 온도 안정성 교대 기준)9,10, 모니터링을 위한 섬세 한 악기 또는 특정 라벨이 방법 필요 합니다. 반면, 협회 수행 하 고 검색 하기가 쉽습니다.
국제 협회에 대 한 원리는 아미노 터미널과 carboxyl 터미널 반쪽 luciferase (라는 N-뤽 또는 C-뤽, 각각)의 A와 B, 단백질과 단백질 식물 세포에 동시에 표현 했다이 두 퓨전으로 융합 했다. 단백질 A, 단백질 B와 상호 작용 하는 경우 다음 luciferase의 두 반쪽 됩니다 수 재구성 된다 될 활성 luciferase 효소. 루미 노 또는 CCD 카메라 luciferase 활동을 감지할 수 있습니다. 그것은 협회;에 대 한 안정 된 transformants를 얻을 필요가 없습니다. 과도 식 고급 상호 작용 결과 얻기에 충분 하다.
링 타입 E3 유비퀴틴 리가 제정 photomorphogenic 1 (COP1) 녹음 방송 요인의 무수 한와 상호 작용 하 고 26S 프로테아좀11그들의 저하를 촉진 합니다. 이러한 COP1 대상 녹음 방송 요인 중 일부는 photomorphogenesis에 대 한 긍정적인 레 귤 레이 터입니다. 어둠 속에서 COP1 phytochrome A-105 1 (SPA1), COP1 E3 활동8향상의 억압으로 작용 합니다. 빛의 지 각, 후 대뇌 COP1 활동을 억제 하 고 COP1 기판12,,1314다음 안정화 COP1-SPA1 상호 작용을 파기 됩니다. 이 예제에서는 PPI를 공부 하 고 PPI 역학 생물 학적 의미를 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Transformation solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Morpholineethanesulfonic acid</td><td>VETEC</td><td>V900336&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27.8 mM Glucose</td><td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 mM&lt;span class=&quot;font7&quot;&gt; MgCl&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font9&quot;&gt;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font10&quot;&gt;&amp;times;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font7&quot;&gt;6H&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font9&quot;&gt;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font7&quot;&gt;O&lt;/span&gt;</td><td>VETEC</td><td>V900020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>150 &amp;mu;M Acetosyringone</td><td>ALDRICH</td><td>D134406&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5.7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Luciferin working buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Luciferin potassium salt</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>0.025% Triton X-100</td><td>VETEC</td><td>V900502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;span class=&quot;font9&quot;&gt;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font7&quot;&gt;O to 10 ml&lt;/span&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

luciferase complementation imaging assay in nicotiana benthamiana leaves for transiently determining protein-protein interaction dynamics

단백질 단백질 상호 작용은 릴레이 신호 변환 가장 세포질 과정;에 대 한 기본 메커니즘 그러므로, 소설 단백질-단백질 상호 작용 쌍 및 단백질 상호 작용 역동성을 모니터링 드러내는 식물 환경 요인 및 발달 신호에 응답 하는 방법에 대 한 특별 한 관심의 이다. 접근의 과다 단백질 단백질 상호 작용, 체 외에서 또는 vivo에서검토 개발 되었습니다. 그 중 최근에 설립 된 luciferase 보완성 (협회) 이미징 분석 결과가 이다 vivo에서 단백질-단백질 상호 작용 위한 간단 하 고 빠른 방법. 이 분석 결과에서 단백질 또는 단백질 B는 융합 luciferase의 아미노 맨끝 또는 carboxyl 터미널 반 각각. 단백질 단백질 B로 할 때, luciferase의 두 반쪽 기능과 활성 luciferase 효소를 형성 하는 재구성 된다 것입니다. 루미 노 또는 CCD 카메라 luciferase 활동을 기록할 수 있습니다. 다른 방식에 비해, 질적 및 양적 협회 분석 결과 단백질 단백질 상호 작용을 보여줍니다. Nicotiana benthamiana 잎에서 Agrobacterium 침투 과도 단백질 표정에 대 한 널리 사용된 시스템입니다. 협회 및 과도 식의 조합으로, 이러한 접근 COP1와 SPA1 간의 실제 상호 작용 jasmonate 치료 후 서서히 감소 되었다 보여줍니다.

세 가지 주요 단계 단백질 단백질 상호 작용에서 vivo에서, 식물 성장, luciferase 분석 결과, 담배 침투 등 공부에 대 한이 luciferase 보완성 프로토콜에 점찍어 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 액체 A. tumefaciens 명. benthamiana 잎 (그림 1)에 침투 하는 것은.
여기에 jasmonate CO...

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Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

luciferase-complementation-imaging-assay-nicotiana-benthamiana-leaves

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

13.9K 조회수.  Nanjing Normal University. 이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

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Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

연구

생물학

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

면역학 및 감염병학

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous complexes formed by nucleotide sugar transporters (NSTs). These ER- and Golgi-resident multitransmembrane proteins carry the cytoplasmically synthesized nucleotide sugars across organelle membranes to supply enzymes that mediate glycosylation with their substrates. NSTs exist as dimers and/or higher oligomers. Heterologous interactions between&#160;different NSTs have also been reported. To verify whether the technique is suitable for studying the phenomenon of NST heteromerization, we tested it against a combination of the two Golgi-resident NSTs that have been previously shown to associate by several other means. The&#160;luciferase complementation assay appears to be particularly suitable for studying interactions between Golgi-resident membrane proteins, as it does not require high expression levels, which often trigger protein mislocalization and increase the risk of false positives.

The&#160;protocol presented here is intended to demonstrate the occurrence of heterologous interactions between Golgi-resident type III membrane proteins with cytoplasmically exposed N- and/or C-termini in live mammalian cells using the most recent variant of the split luciferase complementation assay.

스플릿 루시퍼라아제 보체 분석을 사용하여 골지-레지던트 타입 III 막 단백질에 의해 형성된 이종 복합체의 시연

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

BIFC-FRET-FLIM 분석체에 의한 MADS 박스 전사 계수의 두 단백제와 칼슘 센서 단백질 간의 삼자 상호 작용 결정

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer

Epigenetic regulation of gene expression is commonly affected by histone modifying enzymes (HMEs) that generate heterochromatic or euchromatic histone marks for transcriptional repression or activation, respectively. HMEs are recruited to their target chromatin by transcription factors (TFs). Thus, detecting and characterizing direct interactions between HMEs and TFs are critical for understanding their function and specificity better. These studies would be more biologically relevant if performed in vivo within living tissues. Here, a protocol is described for visualizing interactions in plant leaves between a plant histone deubiquitinase and a plant transcription factor using fluorescence resonance energy transfer (FRET), which allows the detection of complexes between protein molecules that are within &#60;10 nm from each other. Two variations of the FRET technique are presented: SE-FRET (sensitized emission) and AB-FRET (acceptor bleaching), in which the energy is transferred non-radiatively from the donor to the acceptor or emitted radiatively by the donor upon photobleaching of the acceptor. Both SE-FRET and AB-FRET approaches can be adapted easily to discover other interactions between other proteins in planta.

Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer

Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is an imaging technique for detecting protein interactions in living cells. Here, a FRET protocol is presented to study the association of histone-modifying enzymes with transcription factors that recruit them to the target promoters for epigenetic regulation of gene expression in plant tissues.

형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

Epigenetic regulation of gene expression is commonly affected by histone modifying enzymes (HMEs) that generate heterochromatic or euchromatic histone ...

<meta charset="utf8"></head><body>Plasmodesmata Function 탐색: 표적 단백질의 공초점 현미경

Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Plasmodesmata are membranous nanopores that connect the cytoplasm of adjacent plant cells and enable the cell-to-cell trafficking of nutrients, macromolecules, as well as invading viruses. Plasmodesmata play fundamental roles in the regulation of intercellular communication, contributing to plant development, environmental responses, and interactions with viral pathogens. Discovering plasmodesmal localization of plant or viral proteins could provide useful functional information about the protein and is important for understanding the mechanisms of plant-virus interactions. To facilitate these studies, we describe a protocol for confocal microscopy-based analysis of different plasmodesmal targeting proteins to select the best plasmodesmal marker for studying the virus-plasmodesmata interactions or plasmodesmal transport. Specifically, the analyses of these events are illustrated using the cell-to-cell movement protein (MP) of the Turnip vein-clearing virus (TVCV), the Arabidopsis Plasmodesmata-Localized Protein 5 (PDLP5) and Plasmodesmata Callose-Binding Protein 1 (PDCB1). The protein plasmodesmal localization data are analyzed in parallel with the global visualization of plasmodesmata using aniline blue staining of the sampled tissues. These approaches can be easily adapted to analyze the plasmodesmal localization of any cellular or pathogen proteins in planta.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 식물의 Plasmodesmata에서 단백질 국소화에 대한 현미경 분석

This protocol describes the selection of optimal plasmodesmal markers for confocal microscopy-based analyses of protein targeting to plasmodesmata during virus-plasmodesmata interactions or plasmodesmal transport.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

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