Name: in vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (gm-csf)-producing t helper (thgm) cells
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
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이 연구는 싱가포르 국립 대학교 건강 시스템 (T1-2014 년 10 월-12 및 T1-2015 년 9 월-10)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜에서 사용 하는 모든 마우스 C57BL/6 유전 배경에 되었고 싱가포르 국립 대학에서 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관. 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용의 싱가포르의 국가 대학 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 수행 했다.
1. 시 약 및 재료 준비
<ol><li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 하는 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 500 mL를 준비 합니다. 참고: 최적의 결과 대 한 전체 절차를 통해 얼음에 버퍼를 유지 합니다.</li>
	<li>완전 한 RPMI 미디어 포함 된 RPMI 1640, 10 %FBS, 및 1% 페니실린 스 50 mL를 준비 합니다. 50 µ M THGM 세포 분화에 대 한 β-mercaptoethanol을 포함 하는 완전 한 RPMI 미디어를 사용 합니다. 증기 두건에서 β-mercaptoethanol을 추가 합니다.</li>
	<li>안티-CD3e 집중 재고 3 μ g/mL PBS에 희석 하 여 안티-CD3e 항 체 혼합물의 7.5 mL를 준비 합니다. 각 항 체 혼합물의 추가 150 μ에 의해 코트 48-잘 접시 고 하룻밤 또는 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 4 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>한 쌍의가 위와 집게를 소독 하 고 70% 에탄올 해 사이에서 그들을 유지.</li>
</ol>2입니다. Murine Splenocytes의 준비
<ol><li>(6-8 주 이전)의 마우스를 안락사 제도 승인 CO2 질 또는 자 궁 경부 전위를 사용 하 여. 70% 에탄올으로 마우스를 살포 하 고 그 뒤에 폴리스 티 렌 블록에 마운트. 생물 안전 캐비닛 다음 단계를 진행 하는 마우스를 전송 합니다.</li>
	<li>집게의 쌍을 사용 하 여 피부를 개최 하 고 약 4 cm,가 위를 사용 하 여 왼쪽에 흉 곽 아래 피부를 잘라. 비장을 노출 하 고 메 마른 집게를 사용 하 여 비장 추출 복 주머니를 엽니다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 70 μ m 셀 스 트레이너를 놓고 미리 버퍼의 2 mL와 함께 그것을 젖은. 셀 스 트레이너 (한 셀 스 트레이너에 대 한 2-3 spleens)에 spleens를 놓고 5 mL 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 macerate.</li>
	<li>모든 셀 튜브에 플러시됩니다 때까지 스 트레이너 및 여러 번 셀 절연 버퍼의 1-2 mL와 함께 튜브를 헹 굴. 셀 스 트레이너를 삭제 하 고 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>감기 (4 ° C) 암모늄-염화-칼륨 (ACK) lysing 버퍼 (150 m m NH4Cl, 10 m m KHCO3, 0.1 m m 나2EDTA, pH 7.2-7.4)의 5 mL와 함께 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 부드럽게 중화 ACK를 완전 한 RPMI 미디어의 2 분 추가 10 ml 그들을 혼합합니다 버퍼 및 즉시 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심 원심 분리 후에 상쾌한 폐기.</li>
</ol>3. 격리의 CD4 + T 세포 세포 분리 열과 마그네틱 CD4 Microbeads를 사용 하 여
<ol><li>셀 절연 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 세포 현 탁 액 모든 파편을 제거 하는 새로운 15 mL 튜브에 사전 분리 필터 (30 μ m)를 사용 하 여 필터링 합니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 10 μ 고 버퍼의 90 μ를 추가 하 여 10 배 희석을 만들. 10 μ 희석된 세포 현 탁 액의 고 trypan 블루 셀 카운팅을 위한 10 μ 함께 섞는다. 실행 가능한 세포의 수익률을 확인 하려면 hemocytometer 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>350 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>107 셀 당 90 μ 버퍼의 셀을 resuspend. 마그네틱 CD4 microbeads 107 셀 당 10 μ를 추가 합니다. 4 ° c.에서 15 분에 대 한 셀을 품 어 최적의 결과 대 한 혼합 셀 서 스 펜 션 5 분에 부드럽게 부 화 하는 동안.</li>
	<li>셀은 잠복기 동안 마그네틱 스탠드에 분리 열을 배치 합니다. 미리 열 버퍼의 2 mL을 젖은.</li>
	<li>셀/구슬 외피의 끝에, 버퍼의 5 mL로 세포 세척 및 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g 에서 원심 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 버퍼의 1 mL에 셀, 셀 분리 열에는 샘플을 로드 하 고 통과 하자. 15 mL 원심 분리기 튜브를 사용 하 여 CD4 세포 분수를 수집. 그것은 건조 하기 전에 저수지를 씻어 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 2 x 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에서 셀 분리 열을 제거 하 고 새로운 15ml 원심 관에 배치. 셀 분리 열 셀 절연 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 고 열에서 셀을 단단히 플런저를 적용.</li>
	<li>CD4 + 세포를 4 ° C에서 5 분 동안 350 x g 에서 분수 원심 폐기는 상쾌한.</li>
</ol>4. 정화 순 CD4 + T 세포 (CD4+CD25-CD44loCD62L안녕) 형광 활성화 된 세포 분류와 THGM 차별화 하 여
<ol><li>버퍼의 500 µ L에서 얻은 CD4 + 세포 pellet을 resuspend. 형광 활용 된 항 체 혼합물 CD4-PerCp를 포함 하는 셀 믹스 (2.8 µ g/mL), CD44 APC (2.4 µ g/mL), CD25-PE (2 µ g/mL), 및 CD62L FITC (10 µ g/mL) (표 1). 빛에서 그들을 보호 하면서 20-30 분 동안 얼음에 셀을 품 어. 참고: 항 체의 농도 이전 실험실에 최적화 했다. 나열 된 항 체의 수는 1-2 마우스에서 셀입니다.</li>
	<li>부 화 후 버퍼의 5 mL로 세포 세척 하 고 350 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포를 원심</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 resuspend 버퍼의 500 µ L에 셀. 다시 나일론 메쉬를 사용 하 여 셀을 필터링 합니다.</li>
	<li>셀 정렬 FACS 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 버퍼의 500 µ L 컬렉션 FACS 튜브 precoat</li>
	<li>얻기는 CD4+CD25-CD44loCD62L안녕하세요 인구 (순진한 CD4의+ T 세포) FACS 정렬. CD4에 게이트+CD25- 첫 번째, 및 다음 선택 CD44loCD62L안녕하세요 셀이이 인구에서.</li>
	<li>순진한 CD4 수집+ T 새로운 15 mL 원심 분리기 관으로 분수를 셀. 350 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>50 µ M β-mercaptoethanol을 포함 하는 완전 한 RPMI 미디어에 106 셀/mL의 농도에서 순진한 CD4 + T 세포 resuspend</li>
	<li>안티-CD3e 항 체를 precoating 48-잘 접시에 대 한 사용 발음 일리노이-7 각 잘에서 씨 0.25 백만 (250 µ L) 셀 (2 ng/mL), 안티-CD28 (1 µ g/mL), 및 안티-IFNγ (10 µ g/mL) (표 1). 참고: 사이토카인 및 항 체의 농도 이전 THGM 세포 분화에 대 한 실험실에 최적화 했다.</li>
	<li>3 일 동안 5% CO2 와 37 ° C에서 세포를 품 어. 매체는 인큐베이션 기간 동안 변경 하지 마십시오.</li>
</ol>5. 마우스 THGM 셀의 분석 생체 외에서 생성
<ol><li>현미경을 사용 하 여, 세포 분화 3 d 분화 후 확인 합니다. 세포를 수확 하 고 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g 에서 원심 2 세포를 씻어 완전 한 RPMI 미디어와 x. 참고: 차별화 된 셀은 순진한 CD4 + T 세포 보다 크기가 큽니다.</li>
	<li>완전 한 RPMI 미디어의 1 mL에 셀 resuspend 세포 현 탁 액의 10 μ 고 trypan는 hemocytometer와 휴대폰 번호를 확인 하려면 파란색의 10 μ 함께 잘 섞는다. Restimulation 및 분석에 대 한 세 가지 묘약으로 차별화 된 셀을 나눕니다. 참고: 세포내 cytokine 얼룩과 ELISA 분석 실험 필요 이들 백만 셀, 그리고 정량 분석 ≥ 1 백만 세포가 필요 합니다.</li>
	<li>
세포내 cytokine 얼룩에 대 한 restimulate phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 셀 (100 ng/mL)와 단백질 수송 억제제 (1 µ L/mL) 4-6 h 존재 ionomycin (1 μ g/mL).
	<ol>
<li>세포를 수확 하 고 안티-CD4 항 체로 그들을 얼룩 (PerCP 활용 된 0.2 mg/mL, 1: 100 희석; 또는 FITC 활용, 0.5 mg/mL, 1: 100 희석) 30 분.</li>
		<li>20-60 분에 대 한 고정 버퍼의 200 μ와 셀을 수정 합니다. 고정 후 씻어 셀 2 x permeabilization 버퍼의 1 mL.</li>
		<li>GM-CSF (PE 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석)에 대 한 항 체와 세포내 얼룩 IL-17A (FITC 활용, 0.5 mg/mL, 1: 100 희석; 수행 APC-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석), 일리노이-4 (APC 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석), 및 IFNγ (APC 활용, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석; PE-conjugated, 0.2 mg/mL, 1: 100 희석) 어둠 속에서 30 분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차별화 된 세포 cytokine 유전자 발현의 정량 분석을 위해 (1.3 단계에서 설명한 대로 접시 precoating) 플레이트-바인딩 안티-CD3e (3 μ g/mL)와 셀을 활성화 합니다. 자극 후 3 h는 정량에 대 한 cDNA를 준비 하는 페 놀 RNA 추출 시 약을 사용 하 여 전체 RNA를 분리 하는 세포를 수확. 프라이 머와는 정량에 사용 하는 프로그램 표 2 와 3, 각각 나열 됩니다.</li>
	<li>차별화 된 세포 cytokine 단백질 분 비의 분석을 위해 24 h (1.3 단계에서 설명한 대로 접시 precoating) 플레이트-바인딩 안티-CD3e (3 μ g/mL)와 셀 restimulate. 그들의 농도 결정 하는 IL-17 및 GM-CSF ELISA 표면에 뜨는 세포 배양 수확.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+cells:+fates,+functions,+and+faults.">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li><li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+immune+responses:+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity.">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).</li><li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Immunology+meets...Immunology:+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4++T+cells.">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).</li><li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH17+cells+in+development:+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming.">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li><li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation.">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li><li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells,+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation.">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li><li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+encephalitogenicity+of+T(H)17+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF.">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17++T+helper+cells.">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF.">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li><li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+Neuroinflammation:+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage.">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 생체 외에서 THGM 차별화의 마우스 순진한 CD4 + 세포, 메서드를 확인 하기 위해 차별화 된 세포의 분석에 의해 뒤에서 프로토콜을 설명 합니다. 노트, 비장 및 림프절 순진한 CD4 + T 세포 정화와 THGM 차별화에 대 한 사용할 수 있습니다. 세포내 cytokine 얼룩 cytometry 셀의 약 55% 보여주었다 결합에 의해 결정 하는 cytokine 식 THGM 상태 (그림 1A</stron...

CD4 + T 도우미 (TH) 세포는 미생물 병원 체에 대 한 호스트 방어, 암 감시, 그리고 면역1,2,3중요 한 역할을가지고 면역 시스템의 필수적인 구성 요소입니다. T 세포 수용 체 (TCR) 활성화, 순진한 CD4 + T 세포는 TH1, TH2로 분화 될 수 있다, TH 17, 또는 규제 T (Treg) 세포 다른 cytokine milieus2,4, 의 영향 5. 최근, 주로 GM-CSF 생산, TH 세포의 새로운 하위 집합 확인 되었고 THGM6라는. THGM 세포의 분화는 신호 변환기의 활성화 및 전사 5 (STAT5)의 활성을 통해 일리노이-7에 의해 구동 됩니다. 다른 TH의 낮은 표현 하면서 GM-CSF의 큰 금액을 표현 하는 이러한 세포-세포 IFNγ 및 IL-176등 서명 cytokines. GM-CSF는 CD4 + T 세포 중재 neuroinflammation7,8의 개발에 중요 한 역할을 발견 했다. IFNγ-또는 IL-17-표현 autoreactive T 세포에 비해, GM-CSF 표현 T 세포는 이전 질병 발병과 높은 질병 심각도 야생-타입에 전송된 (WT) 마우스. 또한, Csf2-/-T 세포 하지 못했습니다 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 유도 adoptively WT 받는 사람에 게 전송 후 IFNγ 또는 IL-17A 부족 한 T 세포 EAE7을 중재 하는 기능을 유지 하는 반면. 또한, 중화 항 체를 사용 하 여 GM-CSF의 봉쇄 ameliorated EAE 질병 심각도8. 또한, 마우스에서 T 세포에 STAT5의 결핍 EAE 개발6저하 THGM 세대에서 그리고, 따라서, 생쥐의 저항에서 결과. 이러한 연구 결과 면역 neuroinflammatory 질병에서 GM-CSF 표현 TH 세포의 중요성을 밑줄. 따라서, GM-CSF 표현 TH 순진한 CD4 + T 세포에서 세포를 분화 하는 방법을 구축 면역 neuroinflammation 및 T 세포 중재 면역 응답의 pathogenesis의 연구에서 중요 한 것입니다. 그러나, 프로토콜을 효율적으로 THGM 세포에서에서 생성 murine 순진한 CD4 + 설립 되지 않았습니다.
여기 우리 순진한 CD4 + T 세포에서 murine THGM 셀을 구분 하는 방법 제시. 이 프로토콜에서 마우스 비장 추출, 단일 세포 현 탁 액, CD4 긍정적인 선택, 정렬 (FACS), 형광 활성화 된 세포 및 TH 세포의 준비를 포함 하 여 모든 절차에 설명 감 별 법 및 분석입니다. 차별화 된 T 보조 세포 mRNA 수준에서 cytokine 식을 결정 하려면 양적 실시간 PCR에 의해 단일 세포 수준에서 cytokine 식을 결정 하려면 cytometry 결합 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 의해 분석 되 고 단백질 수준에서 cytokine 식 평가 하 일 라 여. 이 메서드는 THGM EAE, GM-CSF, 병 인에 중요 한 역할 등 다양 한 조건 하에서 세포 생물학의 연구에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0500-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS Heat Inactivated</td><td>Capricorn</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>1st Base</td><td>BUF-2040-10</td><td>Diluted to 1x PBS in sterile water</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>1st Base</td><td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td><td></td></tr><tr><td>10x ACK buffer</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>diluted in sterile water</td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>SPL Life Sciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>CD4 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>LS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>magnetic stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Sony SY3200 cell sorter</td><td>Sony</td><td>Sony SY3200 cell sorter</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical centrifuge tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>FACS tube</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>24 well cell culture plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0041-82</td><td></td></tr><tr><td>PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55)</td><td>eBioscience</td><td>12-0251-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-human/mouse CD44 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD62L FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0621-85</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-improved counting chamber</td><td>Marienfeld</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Trypan Blue Solution</td><td>GE healthcare Life Sciences</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Nikon</td><td>Nikon Elipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Purified&amp;nbsp;anti-mouse CD3e&amp;nbsp;antibody</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>Purified hamster anti-mouse CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Purified Rat&amp;nbsp;anti-mouse IFN&amp;gamma; &amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>16-7312-85</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-mouse IL-4 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>504102</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse IL-7 Protein</td><td>R&amp;amp;D system</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human TGF-beta</td><td>R&amp;amp;D system</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Merck Millipore</td><td>19-144</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug protein transport inhibitor</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2301KZ</td><td></td></tr><tr><td>Intracellular Fixation&amp;amp;Permeabilization buffer set</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse GM-CSF PE</td><td>eBioscience</td><td>12-7331-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse IL-17A</td><td>Biolegend</td><td>506908</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse IFN-gamma</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>GO Taq qPCR master mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td></td></tr><tr><td>mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td><td>invitrogen</td><td>88-7334-88</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-17A Uncouted ELISA</td><td>invitrogen</td><td>88-7371-22</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (gm-csf)-producing t helper (thgm) cells

Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T 도우미 (THGM) 셀 생산은 주로 인터페론 (IFN) γ 또는 인터 루 킨 (IL)-17 생산 하지 않고 GM-CSF를 분 비 하 고 발견 된다 새로 확인된 된 T 도우미 셀 하위 집합 면역 neuroinflammation에 필수적인 역할을 재생 합니다. Splenocytes의 단일 세포 현 탁 액에서 순진한 CD4 + T 세포 및 THGM 순진한 CD4 + T 세포에서 세포 생성의 격리 하는 방법 T 세포 중재 면역과 면역 질환의 연구에 유용한 기술 될 것 이다. 여기는 일리노이-7에 의해 추진 THGM 셀으로 마우스 순진한 CD4 + T 세포를 구분 하는 방법에 설명 합니다. 분화의 결과 세포내 cytokine cytometry, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)와 함께 얼룩을 포함 하 여 다른 기술을 사용 하 여 cytokines 식의 분석에 의해 평가 되었다 고 효소 연결 된 immunosorbent 분석 (ELISA) 프로토콜을 사용 하는 THGM 차별화 설명 여기, 세포의 약 55 %IFNα 또는 IL-17의 최소한의 표현으로 GM-CSF를 표현. GM-CSF THGM 세포의 주된 표현 추가 GM-CSF, IFNα, 및 mRNA와 단백질 수준에서 IL-17의 발현의 분석에 의해 확인 되었다. 따라서,이 메서드는 순진한 CD4 + T 세포 T로 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다HGM에서 생체 외에서세포는 THGM 세포 생물학의 연구에 도움이 될 것입니다.

2 8 주 오래 된 남성 C57BL/6 쥐에서 고립 된 naive CD4 + T 세포 세 부분으로 분할 되었다. 세포의 한 부분 설명 하는 프로토콜에 따라 THGM 세포로 분화 했다. 다른 부분 THGM의 차별화에서 IL-4 봉쇄의 영향을 테스트 안티-일리노이-4 항 체 (10 µ g/mL)의 THGM 조건 하에서 경작 되었다. 마지막 부분 (3 µ g/mL 안티-CD3e, 1 µ g/mL 안티-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL 일리노이-...

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In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

생체 외에서 마우스 Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T (THGM) 도우미 셀 생산

여기, 우리가 순진한 CD4 + T 세포, 순진한 CD4 + T 세포, THGM의 차별화의 격리를 포함 하 여에서 murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T 도우미 (THGM) 세포를 분화 하는 프로토콜을 제시 하 고 차별화 된 THGM 셀의 분석. 이 메서드는 규칙의 연구 및 THGM 세포의 기능에 적용할 수 있습니다.

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

in-vitro-differentiation-mouse-granulocyte-macrophage-colony

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

7.1K 조회수.  National University of Singapore. 여기, 우리가 순진한 CD4 + T 세포, 순진한 CD4 + T 세포, THGM의 차별화의 격리를 포함 하 여에서 murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T 도우미 (THGM) 세포를 분화 하는 프로토콜을 제시 하 고 차별화 된 THGM 셀의 분석. 이 메서드는 규칙의 연구 및 THGM 세포의 기능에 적용할 수 있습니다.

비디오: In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

연구

암 연구학

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

면역학 및 감염병학

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of hematological pathologies. Despite the most relevant data that can be acquired using in vivo models or primary cultures, the low abundance of hematopoietic stem and progenitor cells considerably restricts the pool of suitable techniques for their investigation. Therefore, the use of cell lines allows sufficient production of biological material for the performance of screenings or assays that require large cell numbers. Here we present a detailed description, readout, and interpretation of proliferation and differentiation assays which are used for the investigation of processes involved in myelopoiesis and neutrophilic differentiation. These experiments employ the 32D/G-CSF-R cytokine dependent murine myeloid cell line, which possesses the ability to proliferate in the presence of IL-3 and differentiate in G-CSF. We provide optimized protocols for handling 32D/G-CSF-R cells and discuss major pitfalls and drawbacks that might compromise the described assays and expected results. Additionally, this article contains protocols for lentiviral and retroviral production, titration, and transduction of 32D/G-CSF-R cells. We demonstrate that genetic manipulation of these cells can be employed to successfully perform functional and molecular studies, which can complement results obtained with primary hematopoietic stem and progenitor cells or in vivo models.

Here detailed protocols for culturing the murine myeloid precursor 32D/G-CSF-R cell line, performing viral infections, and carrying out proliferation and differentiation assays are presented. This cell line is suitable for studying myeloid cell development, and the role of genes of interest in myeloid cell growth and neutrophilic differentiation.

확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

발생학

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T 세포의 유도<em&gt; 체외</em&gt; 마우스 배아 줄기 세포에서

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

신경과학

Analysis of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor-Producing T Helper Cells in a Mouse Model of Contact Hypersensitivity

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified as a distinct subset of T helper cells (GM-CSF+ IFN-&#947;- IL-17A- IL-22- effector CD4+ T cells) in human and mice. Contact hypersensitivity (CHS) is considered an excellent animal model for allergic contact dermatitis (ACD) in human, manifesting an intact T cell-mediated immune response. To provide a standardized and comprehensive assay to analyze the Th-GM cell subset in the T cell-dependent immune response in vivo, a murine CHS model was induced by sensitization/challenge with a reactive, low-molecular-weight, organic hapten, 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB). The Th-GM subset in effector CD4+ T cells generated upon immunization with the hapten was analyzed by flow cytometry. We found that Th-GM was mainly expanded in lesions and draining lymph nodes in the DNFB-induced CHS mouse model. This method can be applied to further study the biology of Th-GM cells and pharmacological research of therapeutic strategies centered on GM-CSF in various conditions, such as ACD.

Here, we present a simple and standardized method of analyzing the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper subset in vivo.

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified ...

<meta charset="utf8"></head><body>유세포 분석을 사용한 Naive CD4+ T 세포에서 Th17 세포 분화

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 사이토카인 농도 조절을 사용하여 Th17 세포의 고순도 In Vitro 분화 달성

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

생체 외에서 마우스 Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T (T_HGM) 도우미 셀 생산

요약

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