이 연구는 NIH/NIAID AI112423와 벤자민 K. 첸을 NIH/NIGMS GM113885와 탈리 아 헤 Swartz에 NIH/NIAID K08-AI120806 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 아이 칸 학교 의학의 마운트 시 나이 학장의 흐름 Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다.

1입니다. 대상 셀 라인의 세대
참고:이 단계는 선택 사항; 기존의 RG 대상 셀 라인을 사용 하 여, 2 단계에서 시작.
<ol><li>70% confluent 10 cm 접시 pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE10 와 pCL 10A112 (포장 플라스 미드) [10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10 mL]에 293T 세포11 의 cotransfect는 1:1 비율 (총 20 µ g)에 칼슘에 기초를 둔 transfection13사용 하 여.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브로 접시에서 미디어를 pipetting와 펠 렛의 모든 세포 파편을 23 ° C에서 5 분 동안 3000 x g 에서 튜브 centrifuging 바이러스 표면에 뜨는 48 h 후 transfection의 10 mL를 수확.</li>
	<li>10 mL 주사기를 0.45 μ m 필터를 연결 합니다. 원심, 후 전체 표면에 뜨는 고 주사기를 로드. 깨끗 한 15 mL 튜브로 통해 샘플을 실행 합니다.</li>
	<li>적절 한 크기에 필터링 된 바이러스 상쾌한 약 수 (일반적으로 0.5-1 mL aliquots). 이러한 다음 단계에서 즉시 사용할 수 또는 수 있습니다-80 ° C에서 냉동 고 저장.</li>
	<li>바이러스 성 상쾌한의 50-100 µ L를 사용 하 여 96 잘 접시에는 선택의 셀 라인을 감염. 5% CO2와 37 ° C에서 세포 문화. RFP 신호 대로 24 h (40 X 확대, 532 nm 여기, 588 nm 방출) 형광 현미경에 나타납니다 하지만 최대 72 시간 소요 될 수 있습니다. 참고:이 실험에서 Jurkat 세포 사용 되었다, 그러나 다른 유형 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>10 우물의 시리즈를 설정 하 여 puromycin와 적어도 1을 잘 떠나, 각각 추가 puromycin 선택 불리고 셀 컨트롤 (5 µ g/ml에서 0.5 µ g/mL 농도의 범위 사용;이 5 월 셀 형식에 따라 다릅니다)로 치료. 세포 생존 능력 (셀 세포 puromycin 저항 없이 셀에 발생 합니다) 몇 일 동안에 비해 치료 제어 및 puromycin RFP 표현 셀만 생존의 농도 사용 하 여 모니터. 참고: transfected 세포 생존 하는 동안 untransfected 셀을 살해 하는 농도 선택 합니다.</li>
	<li>단일 셀 흐름 cytometry 정렬 또는 제한 희석 사용 하 여 (참조 단계 1.8-1.10), 단일 셀1 클론 셀 라인 (성장에 몇 주 걸릴 수 있습니다)를 개발 하는 것에서 파생 된 문화를 성장.</li>
	<li>희석 메서드를 사용 하는 경우는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 그리고 약 500 세포/ml 샘플을 희석.</li>
	<li>96 잘 접시에서 [10 %FBS 2% 페니실린 스, Jurkat 세포를 사용 하는 경우와 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체] 미디어의 50 µ L로 셀 희석의 50 µ L 플라스틱 하 고 11 웰 스를 포함 하는 미디어의 50 µ L로 1:1 직렬 희석을 수행 합니다. 최상의 결과 얻으려면 적어도 10 복제를 수행 합니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터 (5% CO2와 37 ° C) 또는 약 4 주 판의 현미경 검사 법 (40 X)을 통해 세포 성장을 모니터링 합니다. 클론 문화에 대 한 (볼 통해 현미경, 40 X)로 성장 최저 puromycin 농도에서 문화를 선택 하십시오.</li>
	<li>23 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 문화 (500, 000 셀/mL는 hemocytometer로 계산)의 20 mL centrifuging와 10 %DMSO FBS의 500 µ L에서 resuspending는 aliquots를 고정 합니다. 셀-냉동 컨테이너를 사용 하 여-80 ° C에서 그것을 배치 하 고 액체 질소에 저장 합니다.</li>
</ol>2. 세포-세포 바이러스 전송
<ol><li>
대상 셀의 준비
	<ol>
<li>37 ° C 물 욕조에 그것을 두어서 Jurkat RG 기자 세포의 해 동 한 500 µ L 유리병. RPMI 완전 한 매체의 10 mL로 세포 유리병에서 플라스틱 및 다음 800 x g 23 ° c.에서 5 분 동안에 혼합물을 원심 20 ml RPMI T-75 플라스 크에 완전 한 매체의 펠 릿을 resuspend. 플라스 크 하룻밤 (37 ° C, 5% CO2)를 품 어. 참고: RPMI 완전 한 매체 RPMI 1640, 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 mg/mL 스 포함 되어 있습니다.</li>
		<li>다음 날, puromycin (미디어의 8 mL 당 2mg/mL 주식의 1 µ L)의 0.5 µ g/mL를 추가 합니다. 200000-800000 셀/mL ( 통해 hemocytometer 계산)의 밀도 유지 하는 세포 문화.</li>
		<li>전송 분석 결과를 설정 하기 전에 하루 puromycin의 0.5 µ g/mL를 포함 하는 신선한 RPMI 매체에 200000-400000 셀/mL까지 셀을 분할 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기증자 세포의 준비
	<ol>
<li>해 동 untransduced Jurkat 세포와 RPMI의 20 mL와 T-75 플라스 크에 그들 완료 중간 (단계 2.1에서에서와 같이), 200000-800000 셀/mL의 조밀도 유지 하는 문화.</li>
		<li>원심 7,500,000 셀 (800 x g 5 분) 및 그들의 보충과 nucleofection 솔루션 V 120 µ L에서 resuspend ( 재료의 표참조). Electroporation 베트 셀 전송 하 고 개 그 iCre1 DNA의 4.5 µ g을 추가 합니다. Transfect 세포 (electroporation 기반 접근을 통해 테이블의 자료를 참조 하십시오)를 적절 한 프로그램 (예:S-18)를 사용 하 여 및 다음 즉시 RPMI 매체의 3 mL에 그들을 전송 (10 %FBS).</li>
		<li>셀 5% CO2와 37 ° C에서 그들을 하룻밤 배양 하 여 복구할 수 있습니다.</li>
		<li>다음날 아침, 23 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 세포를 원심 고 RPMI 완전 한 매체, 2 h 37 ° C (5% CO2)에서 시험 설치를 진행 하기 전에 복구할 수 있도록 3 mL에 그들을 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
공동 문화
	<ol>
<li>(기증자 및 대상 셀)의 분석을 잘 당 50, 000 셀 (800 x g 23 ° C에서 5 분) 내려 hemocytometer 다음 스핀을 사용 하 여 셀을 계산. 1 x 106 셀/mL RPMI puromycin 없이 완전 한에 resuspending.</li>
		<li>한 접시에 추가할 기증자 세포 현 탁 액의 25 µ L 각 잘; 또 다른 접시에 대상 셀의 25 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>각 잘 복합 테스트의 25 µ L 희석 RPMI 적절 한 농도에서 완전 한 매체에 추가 합니다. 30 분 동안 화합물과 기증자 및 대상 셀을 품 어. 참고: 농도 약물 마다 달라 집니다. 알려진된 IC50경우에, 위와 아래에 넣는 출발점으로 서 이것을 사용 합니다. IC50 를 알 수 없는 경우 최종 농도 10 µ M의 200 µ M 재고 준비.</li>
		<li>전처리, 후 다른 한 접시의 내용을 pipetting으로 대상 세포 기증자 세포를 결합 하 고 조직 문화 인큐베이터 5% CO2와 37 ° c에 40 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry
	<ol>
<li>2%의 최종 농도에 각 음에 paraformaldehyde (PFA)를 추가 합니다. 참고: 16% 재고 솔루션에 대 한이 100 µ L 당 14 µ L 잘.</li>
		<li>주의: PFA 노출 된 피부와 눈에 유해한입니다. 실험실 외 투, 장갑, 그리고 안전 고글을 착용 하 고 안전 후드에서 재고 솔루션을 처리.</li>
		<li>MCherry와 FITC 채널 교류 cytometer 셀 읽기. 참고: 그것은 감염 된 세포 vs배경 위에 GFP를 표현 하는 세포의 5-20%를 볼 수 있습니다. 감염 되지 않은 세포.</li>
		<li>GFP 특정 채널에 형광 현미경 검사 법 (40 X) 통해 GFP 신호를 시각화 (여기 필터 400 nm와 508의 방출 필터 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 대체 프로토콜 셀 무료 바이러스 감염에 대 한
<ol><li>
대상 셀의 준비
	<ol>
<li>37 ° C 물 목욕으로 배치 하 여 Jurkat RG 기자 세포의 해 동 한 500 µ L 유리병. RPMI 완전 한 매체의 10 mL로 세포 유리병에서 플라스틱 및 다음 원심 RPMI 완전 한 중간 800 x g 23 ° c.에 5 분에서 20 ml RPMI T-75 플라스 크에 완전 한 매체의 펠 릿을 resuspend. 플라스 크 하룻밤 (37 ° C, 5% CO2)를 품 어.</li>
		<li>다음 날, puromycin (미디어의 8 mL 당 2mg/mL 주식의 1 µ L)의 0.5 µ g/mL를 추가 합니다. 200000-800000 셀/mL ( 통해 hemocytometer 계산)의 밀도 유지 하는 세포 문화.</li>
		<li>전송 분석 결과를 설정 하기 전에 하루 puromycin의 0.5 µ g/mL를 포함 하는 신선한 RPMI 매체에 200000-400000 셀/mL까지 셀을 분할 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀-무료 바이러스의 생산
	<ol>
<li>Transfect 293T 세포11 의 70% confluent 10 cm 접시 (10 %DMEM 10 ml에서 FBS) 칼슘에 기초를 둔 transfection13를 사용 하 여 개 그 iCre1 플라스 미드의 5 µ g를. 참고:이 규모는 약 2 ~ 4 96 잘 접시, 여 transfection 효율에 따라 충분 하다 바이러스의 10 mL을 생산할 예정 이다.</li>
		<li>15 mL 원뿔 튜브로 접시에서 미디어를 pipetting와 펠 렛의 모든 세포 파편을 5 분 동안 3000 x g 에서 튜브 centrifuging 48 h에 전체 바이러스 상쾌한 수확.</li>
		<li>10 mL 주사기를 0.45 μ m 필터를 연결 합니다. 원심, 후 전체 표면에 뜨는 고 주사기를 로드. 깨끗 한 15 mL 튜브로 통해 샘플을 실행 합니다.</li>
		<li>바이러스를 사용 하 여 대상 셀 즉시 (단계 3.3) 감염 또는 동결 하 고-80 ° C (사용 전에 필요에 따라 샘플 thaw)에 바이러스를 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
감염
	<ol>
<li>(에서 단계 3.1.3) RG Jurkat 대상 셀의 개수를 사용 하 여 hemocytometer를 스핀 800 x g 에 잘 당 50000 대상 셀 5 분, puromycin 없이 매체 완료 resuspending 1 x 106 셀/mL RPMI에 셀.</li>
		<li>한 접시에 추가할 RG Jurkat 대상 셀의 25 µ L 각 잘; 별도 접시에 25 µ L 추가 (2 기) 각 우물에 바이러스.</li>
		<li>각 잘 추가 25 µ L 복합, 테스트의 적절 한 농도에서 미디어에 희석 합니다. 셀과 30 분에 대 한 화합물과 바이러스를 품 어. 참고: 테스트 농도 약물 마다 달라 집니다. 알려진된 IC50경우에, 위와 아래에 넣는 출발점으로 서 이것을 사용 합니다. 알 수 없는, 경우 최종 농도 10 µ M의 200 µ M 재고 매체 준비.</li>
		<li>전처리, 후 대상 셀에 우물에서 바이러스/화합물 혼합의 전체 콘텐츠 (50 µ L)를 추가 하 고 조직 문화 인큐베이터 5% CO2와 37 ° c에 40 h에 대 한 모든 것을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry
	<ol>
<li>2%의 최종 농도에 각 잘 PFA 추가. 참고: 16% 재고 솔루션에 대 한이 100 µ L 당 14 µ L 잘.</li>
		<li>MCherry와 FITC 채널 교류 cytometer 셀 읽기. GFP 신호는 GFP 채널에 형광 현미경 시각 을 통해 수 있습니다. 참고: 한 번 감염 된 세포 vs배경 위에 GFP를 표현 하는 세포의 5-20%를 볼 기대할 수 있습니다. 감염 되지 않은 세포.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+identifies+pharmacological+inhibitors+of+HIV+entry.">A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry.</a> Virology. 490, 6-16 (2016).</li><li>Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. 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저자는 공개 없다.

개 그-iCre 분석 결과 바이러스 성 복제의 융해 단계를 억제 수 있습니다 약물 후보 심사에 대 한 매우 도움이 될 입증 되었습니다. 이 분석 결과 수행할 때 좋은 신호를 얻을 가장 중요 한 단계는 대부분의 바이러스 감염 분석 유사. 첫 번째 중요 한 단계는 좋은-품질 바이러스의 높은 titers 생산 하 고 있다. 이 단계에서는 293T 세포 passaged 자주 (적어도 모든 48 h x 1) 그래서 그들은 될 overconfluent와 함께...

소설 항 레트로 바이러스 치료를 위한 필요 에이즈-1의 억제제에 대 한 높은 처리량 스크린의 개발을 자극 했다. 개 그-iCre 기자 분석 결과 특히 호스트 세포 막1바이러스 막 융합을 측정 하 여 셀 감염 시스템에서 융해 단계에서 바이러스 항목의 억제제를 식별 하기 위해 개발 된다. 분석 결과 개발 되었다 바이러스 막 융합의 지점까지 에이즈-1 감염의 초기 단계에서 구체적으로 행동 하는 비 발한 억제제에 대 한 화면으로. 한 도전-셀 감염 측정은 새로운 감염을 측정 하는 것은 입력된 셀에서 차별 어렵다 그래서 초기 inoculum 감염된 기증자 세포와 ininfected 대상 셀 포함. 이상적인 시스템 분리 유전자 마커를 대상 세포 감염의 개시에 의해 유도 될 수 있다 포함 하 고 기증자 세포에 존재 하지 않습니다. 인기 있는 바이러스 내용을 바이러스 성 단백질 효소 퓨전, 연기-Vpr에 따라 분석 결과 혼합 효과적일 수 있다, 그러나 높은 처리량, 셀 심사2에 대 한 제한이 있다. 이 분석 결과 베타-lactamase (연기) 리포터 유전자를 에이즈-1 Vpr을 융합, virions로 포장 이며, 바이러스 성 막 퓨전 시 대상 세포에 전달이 포함 됩니다. 기판 CCF2 오전 대상 세포의 세포질에 로드 하 고 분열 시 형광 변화를 겪 습. CCF2 오전 기판 비싼 이며, 높은 처리 화면에 대 한 금지 될 수 있습니다. 기증자 및 대상 셀을 구별 하기 위하여 그것은 염료 레이블에 필요한 대상 인구. 마지막으로, 프로토콜 화합물의 큰 숫자를 테스트 하는 경우 부담 하 고 비용이 많이 드는 될 수 있는 몇 가지 세척 및 인큐베이션 단계를 요구 한다.
개 그-iCre 분석 결과 높은 처리량 셀 전송에서 퓨전의 억제제에 대 한 검사를 개발 하는 것이 문제에 해결책으로 개발 되었다. 이 시스템은 기판 셀으로 로드할 수 필요 하지 않습니다. 분석 결과 셀 무료 연구에도 사용할 수 있습니다 그리고 의사 형식화 된 HIV-1 개 그-iCre 바이러스 입자를 사용 하 여 다른 바이러스 성 융합 연구에. 그러나 에이즈-1 개 그-iCre 분석 결과3,,45마찬가지로 이러한 실제 바이러스 입자를 사용 하지 않는 HIV 환경을 중재-셀 퓨전 분석 바이러스 환경을 단백질 중재 세포 융합, 측정할 수 있습니다. 이 분석 결과 교류 cytometry 또는 형광 현미경으로 읽을 수 있습니다. 그것은 FDA 라이브러리 뿐만 아니라 purinergic 억제제1,6의 작은 도서관을 화면으로 성공적으로 사용 되었습니다. 다른 수 사관 들도 보고 바이러스 캡슐화 beta lactamase 세포질7,8 로 전송 하는 적응 하 고 최적화 된 높은 처리량 퓨전 분석 결과 사용 하 여 HIV-1 융합 저 해제 purinergic 식별 .
개 그-iCre 바이러스는 매트릭스와 에이즈-1 효소 사이트9에 의해 형벌 capsid Cre recombinase 삽입 개 그-iGFP 바이러스에 유사한 방식으로 설계 되었습니다. Cre 효소 성숙 hiv-1 프로 테아 제 초기 바이러스 입자 내에서 활성화 되 면 개 그 polyprotein 내에서 삽입 하는 전조로 이루어집니다. 따라서, Cre 납품은를 대상 셀 을 통해 바이러스 성 막 융해 과정에 효소 활성화 HIV-1 입자의 내용 전달에 의존 합니다. 프로토콜의 두 가지 버전은 여기에 제공 됩니다. 첫 번째는 에이즈-1 감염 인구를 사용 하 여 직접 셀 전송의 HIV 연구 대상 세포를 감염. 두 번째 버전 셀 무료 바이러스를 사용 하 여 셀 무료 바이러스 감염 연구. 셀 전송 분석 결과 셀은 이미 해 동 하 고 passaged 세포를 해 동 하는 날 로부터 7 일 또는 5 일 걸립니다. 경우에 세포를 해 동 하 여 passaged 셀 무료 감염 분석 결과 5 일 셀 해 동 될 필요가 있는 경우 및 3 일에서 수행할 수 있습니다. 지침은 또한 Clevers 랩10에 의해 만들어진 플라스 미드를 사용 하 여 원하는 셀 형식 (해당 되는 경우 기존의 RG 대상 셀 라인은 사용 하지 않는)에 RG (빨강-녹색) 대상 셀 라인을 생성 하 주어진 다. 적절 한 biosafety 주의 바이러스와 바이러스 표현 셀이 분석이 결과에 찍힌다는 것이 좋습니다. 우리는 BSL2 + 조직 문화 시설에서이 분석 결과의 감염 부분을 수행합니다. 셀 고정 후 표준 흐름 cytometry 및 현미경 시설에서 분석할 수 있습니다.
소설 화합물에 대 한이 분석 결과의 응용 프로그램 화면을 설명 하는 여기 HIV-1 바이러스 막 융합 (그림 1)을 억제. Purinergic 수용 체는 프로-염증 성 중재자. 우리 연구소는 비 선택적 억제제 purinergic 수용 체의 억제제 에이즈-1 바이러스 막 퓨전6의 행위로 설명 했다. 우리는 높은 처리량이 분석 결과의 활용 소설 HIV-1 바이러스 막 융합 억제제를 식별할 수 있는 것을 보고 합니다. Purinergic 클래스의 수용 체의 억제제 에이즈-1 바이러스 막 융합 억제제의 새로운 클래스를 나타냅니다 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5546</td><td>Media for 293 Cells</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0883</td><td>Media for Jurkats</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Albumin</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td>Serum for 293 Cells</td></tr><tr><td>Cosmic Calf Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.03</td><td>Serum for Jurkat Cells</td></tr><tr><td>Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>SV30010</td><td>Penn/Strep used in both media</td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>3073</td><td>Used for Culture of Jurkat Cells</td></tr><tr><td>10 cm Tissue Culture Plates</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Used for Culture of 293 Cells</td></tr><tr><td>96 Well Plates (tissue culture Treated)</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>Used for fusion assay</td></tr><tr><td>Polyjet Transfection Reagent</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td>Used to transfect 293 Cells</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-100ML</td><td>Used in wash steps</td></tr><tr><td>Hyclone Trypsin Protease</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>SH30042.01</td><td>For Trypsinization of 293 cells</td></tr><tr><td>Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>For Nucleofection of Jurkats</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>17144002</td><td>For Nucleofection of Jurkats</td></tr><tr><td>Serological Pipettes</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-11E</td><td>For all tissue culture</td></tr><tr><td>Pipettor Tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td>For all tissue culture and liquid handling steps</td></tr><tr><td>Millex Syringe Filter (0.45 &amp;mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SLHA033</td><td>For filtration of virus</td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile syringes</td><td>BD Diagnostics</td><td>309656</td><td>For filtration of virus</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>2b</td><td>for Nucleofection of Jurkats (various models available)</td></tr><tr><td>BD Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>for flow cytometry analyss of samples</td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>Various models</td><td>Fortessa 2</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE</td><td>Addgene</td><td>32702</td><td>&lt;strong&gt;Koo BK&lt;em&gt; et al.&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt; Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods &lt;strong&gt;9:&lt;/strong&gt;81-83 (2011).</td></tr><tr><td>pCL10a1</td><td>Novus Bio</td><td>NBP2-29542</td><td>&lt;strong&gt;Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I&lt;/strong&gt;. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology &lt;strong&gt;70&lt;/strong&gt;: 5701-5705 (1996)</td></tr><tr><td>Gag-iCre</td><td>Benjamin Chen Lab</td><td></td><td>&lt;strong&gt;Esposito AM&lt;em&gt; et al.&lt;/em&gt; &lt;/strong&gt;A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology &lt;strong&gt;490:&lt;/strong&gt;6-16 (2016).</td></tr></tbody></table>

a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion

이 분석 결과 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 구체적으로 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 (GFP) 감지의 표현 하도록 설계 되었습니다. 에이즈-1 기자 바이러스 (에이즈-1 개 그-iCre)는 Cre recombinase 매트릭스와 개 그 polyprotein의 capsid 단백질 V-1 게놈으로 삽입 하 여 생성 됩니다. 다음 대상 셀에 발표 바이러스 입자로 Cre recombinase의 포장에서이 결과 라인 Cre recombinase 활성화 빨간 형광 성 단백질 (RFP) GFP 스위치 카세트를 안정적으로 표현. 기저 상태에서이 카세트만 RFP를 표현합니다. 목표 셀에 Cre recombinase의 배달, 다음 loxP 사이트에 의해 형벌 RFP, GFP 식 결과 excises. 이 분석 결과 어떤 억제제 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 셀 및 셀 감염 시스템에서 테스트를 사용할 수 있는 그리고 HIV-1 바이러스 막 융합의 비 발한 억제제로 purinergic 수용 체 길 항 근의 클래스를 식별 하는 데 사용 되었습니다.

감염 되지 않은 RG Jurkat 세포 (그림 2A, 감염 되지 않은 열) 매우 강한 RFP 신호 배경 GFP 신호 (0.3%)의 낮은 수준 전시. 개 그-iCre 감염 에이즈-1 융합 억제제 AMD3100의 존재 동안 GFP 신호 (24.9%) 증가 하면 (20 µ M)이이 신호를 감염 되지 않은 배경 수준 (0.34%)으로 데 려의 개발을 억제. 때 반전 녹음 방송 억제 물 어 같은 후 퓨전 이벤트의 억제제 (2 µ M) 사용, 신...

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A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

a-high-throughput-cre-lox-activated-viral-membrane-fusion-assay-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.3K 조회수.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Immunology Institute. 우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

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Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

연구

생화학

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

면역학 및 감염병학

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해<em&gt; 시험관</em&gt; HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

생물학

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) formats. The flavivirus non-structural (NS) proteins are thought to co-translationally assemble on the endoplasmic reticulum (ER) membranes, forming the replication complex (RC). The NS3 and NS5 are the most studied enzymes of the RC and constitute the main targets for drug development due to their crucial roles in viral genome replication. NS3 protease domain, which requires NS2B as its cofactor, is responsible for the cleavage of the immature viral polyprotein into the mature NS proteins, whereas NS5 RdRp domain is responsible for the RNA replication. Herein, we describe in detail the protocols used in replicon-based screenings and enzymatic assays to test large compound libraries for inhibitors of the Zika virus (ZIKV) replication. Replicons are self-replicating subgenomic systems expressed in mammalian cells, in which the viral structural genes are replaced by a reporter gene. The inhibitory effects of compounds on viral RNA replication can be easily evaluated by measuring the reduction in the reporter protein activity. The replicon-based screenings were performed using a BHK-21 ZIKV replicon cell line expressing Renilla luciferase as a reporter gene. To characterize the specific targets of identified compounds, we established in-vitro fluorescence-based assays for recombinantly expressed NS3 protease and NS5 RdRp. The proteolytic activity of the viral protease was measured by using the fluorogenic peptide substrate Bz-nKRR-AMC, while the NS5 RdRp elongation activity was directly detected by the increase of the fluorescent signal of SYBR Green I during RNA elongation, using the synthetic biotinylated self-priming template 3&#8242;UTR-U30 (5&#39;-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3&#39;).

In this work, we describe the protocols used in replicon-based and viral enzyme-based assays to screen for inhibitors of Zika virus replication in a high-throughput screening format.

지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience comorbidity related to chronic inflammation despite antiretroviral therapy. However, these inflammatory signaling has not been fully characterized. The role of early entry events on the activation of cellular signaling events and downstream gene expression has not been captured at the single-cell level. Here the authors describe a method that applies principles of live-cell fluorescence microscopy to an automated single-cell platform that cultures and images cells over user-customized time courses, allowing for high-throughput analysis of dynamic cellular processes. This assay can track single-cell live fluorescence microscopy of early events that immediately follow HIV-1 infection, notably the influx of calcium that accompanies exposure to the virus and the development of productive infection using a fluorescent reporter virus. MT-4 cells are loaded with a calcium-sensitive dye and cultured in isolated pens on a nanofluidic device. The cultured cells are infected with an HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). A fluorescence microscope positioned above the nanofluidic device measures calcium influx over an 8-min time course following acute HIV-1 exposure. HIV-1 productive infection is measured in those same cells over a 4-day interval. Imaging data from these time courses are analyzed to define virus-host receptor interactions and signaling pathway dynamics. The authors present an integrated, scalable alternative to traditional imaging methods using a novel optofluidic platform capable of single-cell sorting, culturing, imaging, and software automation. This assay can measure the kinetics of events under various conditions, including cell type, agonist, or antagonist effect, while measuring an array of parameters. This is the first established method for nanofluidic high-throughput longitudinal single-cell culture and imaging: This technique can be broadly adapted to study cellular signaling kinetics and dynamic molecular interactions.

Here, we present a protocol in which single cells are monitored for acute events and productive HIV-1 infection on a nanofluidic device. Imaging data define virus-host receptor interactions and signaling pathway dynamics. This is the first method for nanofluidic high-throughput longitudinal single-cell culture and imaging to study signaling kinetics and molecular interactions.

다중 매개 변수 광유체 플랫폼을 사용하여 칼슘 유입 및 HIV-1 감염의 단세포 특성화

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...