초분해능 구조화 조명 현미경 검사법인 3D-SIM은 포자 막에서 발아 수용체 클러스터의 형광 기자 단백질을 시각화하는 혁신적인 기술입니다. 이러한 절차를 사용하여 발거국화 및 포자 내부 막 지질 도메인의 타의 추종을 불허하는 해상도를 달성할 수 있습니다. 이 기술은 박사 과정 학생 후안 웬과 과학 학생 레이몬드 파스만의 우리의 실험실에 의해 입증될 것입니다.
시술을 시작하기 전에, 부드럽게 흔들리는 수조에서 30 분 동안 1 개의 어금니 염산으로 고정밀 커버립을 청소하고 초순수 타입 1 물에 2 5 분 세척합니다. 두 번째 세척 후 커버립을 100% 에탄올에 약 3분간 놓고 커버립을 건조시키고 선명도를 확인합니다. 그런 다음, 깨끗한 유리 현미경은 슬라이드가 건조하고 선명도를 확인하기 전에 1 분 동안 70 %의 에탄올로 슬라이드.
형광 마이크로스피어 및 포자 이미징의 경우, 70도 섭씨 가열 블록에 처음 두 개의 슬라이드를 한 후 몇 초 동안 미리 따뜻하게 두 개의 슬라이드를 한 후 70도 섭씨, 65 마이크로리터 액적인 멸균 2%의 아가게로 슬라이드 중 하나에 연결됩니다. 슬라이드 사이에 아가로즈를 퍼뜨리기 위해 다른 슬라이드를 위에 놓습니다. 5분 후 슬라이드 중 하나를 제거하고 말린 아가로즈를 1-1센티미터 섹션으로 자른다.
멸균의 0.4 마이크로리터에 8번째 형광 마이크로스피어 또는 포자를 1회 10번 추가하고, 아가로즈에 초순수 타입 1물을 넣고, 커버슬립을 사용하여 패치에 고정밀 커버슬립을 배치하여 슬라이드의 패치를 커버슬립 표면으로 밀어넣습니다. 그런 다음 65 마이크로리터, 1.5-1.6센티미터 유전자 프레임을 말린 슬라이드에 고정하고 커버슬립을 프레임에 배치하여 프레임의 모서리를 모두 닫습니다. 시료의 이미징을 위해 슬라이드를 100X 오일 목표를 갖춘 구조화 된 조명 현미경에 배치하고 100 나노 미터 형광 현미경에 집중하십시오.
이미지의 흐림을 최소화하기 위해 대칭 점 확산 함수가 얻어질 때까지 100x 목표에서 보정 링을 조정하고 약 10개의 둥근 형광 마이크로스피어를 사용하여 시야를 선택합니다. 지정된 여기 파장에 대한 격자 초점 조정을 적용, 이 경우, 561 및 488 나노미터, 전송 광과 포자에 초점을 맞추기 전에 이미지 분석 소프트웨어에 대한 가이드로. 각 이미지에 대해 20밀리초 노출되는 16x 평균 모드에서 전송 광 이미지를 캡처합니다.
이어서, 3D-SIM 조명 모드로 포자의 3D 구조화 조명 현미경 원시 형광 영상을 캡처한다. 슬라이스 재구성의 경우 구조화된 조명 패드 탭 시트의 Param을 클릭하여 N-SIM 슬라이스 재구성 창을 엽니다. 제안된 지침을 따르고 적절한 컨트롤을 클릭하여 조명 변조 대비를 자동으로 설정하고 고해상도 노이즈 억제를 시작점으로 0.05로 초점 흐림 억제합니다.
그런 다음 슬라이스 재구성을 클릭하여 이미지를 재구성하고 재구성 후 표시되는 빠른 Fourier 변환 이미지와 재구성 점수로 재구성된 이미지의 품질을 평가합니다. 고해상도 노이즈를 0.1에서 5로 조정하고 초점 블러 억제를 0.01에서 0.5로 조정하여 최상의 매개 변수 설정을 얻을 때까지 조정합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 변경 사항을 적용합니다.
창을 닫기 위해 가까이 를 클릭합니다. FM4-64 스테인드 PS4150 포자 원시 이미지를 엽니다. 그런 다음 슬라이스 재구성을 클릭하여 슬라이스 재구성을 실행하고 재구성된 이미지를 저장합니다.
KGB80 geminosome의 3D-SIM 원시 이미지를 의사 와이드 필드 이미지로 변환하려면 ImageJ SIMcheck 플러그인을 왼쪽 클릭하고 원시 데이터 SI 및 의사 와이드 필드를 선택합니다. 약 350개의 포자가 선택될 때까지 형광 의사 와이드필드 이미지에서 나중에 발아성 분석을 위해 각 반전 전송 이미지에서 약 25개의 포자를 임의로 선택한다. 그런 다음 ImageJ를 사용하여 각 포자 그룹과 각 3D 포자 이미지의 통합 강도에 의해 표현된 각 형광 신호에 대한 최대 강도를 평가합니다.
KGB80 germinosome의 의사 와이드필드 이미지를 분석하려면 7개의 스택의 평균 통합 강도 값을 KGB80 포자의 통합 신호 강도로 사용합니다. 그런 다음 동일한 설정을 사용하여 PS4150 배경 변형을 이미징하여 배경 강도를 결정하고, 개별 KGB80 포자의 형광 반점을 배경과 명확하게 구별할 수 있을 때 발거성 포시로 간주합니다. 본 대표적인 실험에서, GerD-GFP 형광 포자의 2개의 포시가 컴포지티브 Z3 스택에서 관찰된 3개의 총 GerD-GFP 포시와 다른 스택에 나타났다.
여기서, 포자에서 하나의 GerD-GFP 초점만을 가진 포자관찰되었다. 총, 포자의 약 40 ~50%는 각각 두 개 또는 하나의 GerD-GFP와 GerKB-mCherry 클러스터를 가지고 있었다. GerD-GFP 스캐폴드 단백질의 통합 강도는 다른 인구마다 달랐지만 GerKB-mCherry의 통합 강도는 다른 인구에서 거의 동일했습니다.
포자가 여러 포시를 가졌을 때, GerD-GFP및 GerKB-mCherry 포시의 최대 형광 강도는 감소하는 경향이 있었고, 발거성 포시로 간주되는 모든 밝은 반점의 최대 형광은 PS4150 의 최대 자동 형광보다 높았다. 특히, 발거성 포시와 유사한 밝은 FM4-64 반점은 그대로 코팅된 PS4150 포자 모두에 나타나며, 이러한 밝은 FM4-64 반점은 내부 막에 있는 발거성 단백질의 클러스터링에 관여할 수 있음을 시사한다. 아가로즈에 포자를 추가하고 프레임에 아가로즈를 배치하려면 이러한 미니 재료에 대한 연속적이고 신중한 유체 움직임이 필요합니다.
KGB80 의 3D-SIM 원시 이미지를 의사 와이드 필드 이미지로 변환하고 해석은 포자 생물학에 대한 전문가의 지식이 필요합니다. 우리의 구조화 된 조명 현미경 검사는 다른 박테리아 또는 다른 밴드 재료에서 낮은 풍부한 단백질 또는 희미한 형광 기자의 이미징에 적용 될 수있다. germinosome의 조직은 지금 바실러스 발아 단백질 및 특정 막 도메인의 공동 현지화를 평가하기 위하여 이중 라벨링 절차를 사용하여 공부될 수 있습니다.
