이 작품 (김 영 연)를 국가 연구 한국 재단 (2015R1D1A1A01060839)에서 교부 금에 의해 그리고 (MSIT) 한국 정부에 의해 자금 한국 국가 연구 재단 (NRF) 교부 금에 의해 지원 되었다 (번호 2016R1A2B2008887 호 2016R1A5A2007009) (Jeanho 윤)에.

1. 노 쇠를 Oncogene 유도 유도
<ol><li>
준비는 H-RasV12 레트로 바이러스
	<ol>
<li>실 온에서 0.001% 폴 리-L-리 신/인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 분의 2 개 mL를 추가 하 여 100 mm 문화 접시 코트.</li>
		<li>진공에 연결 하는 유리 피 펫을 사용 하 여 폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 문화 접시를 세척.</li>
		<li>접시 3 x 106 ecotropic BOSC 23 포장 코팅 문화 접시와 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린/스, 전지와 CO2 조직 문화에서 37 ° C에서 문화 1 d 인큐베이터입니다.</li>
		<li>다음 날, transfect retroviral 포장 DNA (pGAG/폴의 2 µ g과 pVSVG의 0.25 µ g) 함께 pBabe 순수 하지 않아-H-RasV12 DNA의 2 µ g transfection 시 약을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 h에 대 한.</li>
		<li>Transfection 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 8 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>48 h 후 바이러스 성 입자를 포함 하는 미디어를 수집 하 고 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 어떤 세포질 파편을 제거 합니다.</li>
		<li>0.45 μ m 주사기 필터와 h 조-Ras 바이러스 포함 된 미디어를 필터링 합니다. 참고: 어떤 및 효율적인 바이러스 감염에 대 한 바이러스 supernatants의 해빙 하지 마십시오. 최고의 효율을 얻기 위해 바이러스 감염으로 같은 날에 수확 했다를 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
H-RasV12 레트로 바이러스의 감염 WI-38 정상적인 인간의 fibroblasts
	<ol>
<li>10 %FBS 1% 페니실린/스 1 d H RasV12 레트로 바이러스를 수확 하기 전에 포함 된 DMEM 5 x 104 WI-38 셀 60 m m 문화 접시에 접시와 37 ° c.에 1 일에 대 한 문화</li>
		<li>다음 날 성장 매체를 제거 하 고 H-RasV12 레트로 바이러스 미디어의 1 mL을 추가. Polybrene 재고 솔루션 (증류수에 8 mg/mL)의 2 µ L을 포함 하는 성장 매체의 추가 1 mL를 추가 합니다. 습도 37 ℃, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에에서 1 일에 대 한 샘플을 품 어.</li>
		<li>H RasV12 레트로 바이러스 혼합 후 24 h를 제거 하 고 씻어 셀 2 x 1 x PBS. 성장 매체를 추가 하 고 습도 37 ℃, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에에서 2 일 동안 puromycin의 2 µ g/mL로 세포를 치료.</li>
		<li>Puromycin 선택의 2 d, 후 성장 매체를 제거 하 고 씻어 셀 2 x 1 x PBS. 성장 매체를 추가 하 고 셀 습도 37 ℃, 5% CO2 배양 기 전 까지는 지정 된 시간 ( 그림 1A 는 회로도 참조)에 문화.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 모니터링 노화 관련 된 β-galactosidase 통해 노화 얼룩
<ol><li>
다음 재고 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) 디 메 틸 formamide (DMF)에서 20 mg/mL를 준비 합니다. -20 ° c.에 솔루션 저장</li>
		<li>(126 m m) 나2HPO4.7H2O 3.377 g을 용 해 하 여 연산/나트륨 인산 염 버퍼를 준비와 연산 (36.8 m m) 100 mL의 증류수의 0.708 g. 필요한 경우 6.0, pH를 조정 합니다.</li>
		<li>0.5 M 칼륨 ferrocyanide 준비. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장</li>
		<li>0.5 M 칼륨 ferricyanide 준비. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장 참고: 노화 관련 된 β-galactosidase (SA β-gal) 얼룩 솔루션의 pH는 정확한 결과 위해 중요 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5mm 칼륨 ferrocyanide, 5 mM 칼륨 ferricyanide, 20% (v/v) 연산/나트륨 인산 염 버퍼, 그리고 1 mg/mL의 X 재고 솔루션을 diluting 하 여 신선한 SA β-gal 얼룩 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>문화 미디어를 제거 하 고 세척 셀 1 x 1 x PBS. 실 온에서 5 분 동안 3% 포름알데히드와 셀을 수정 합니다. 참고: 셀 하지는 레트로 바이러스와 함께 감염 되는 부정적인 컨트롤으로 사용 한다. 감염된 제어 셀 proliferating 그들의 상태를 유지 하기 위해 passaged를 계속 해야 합니다.</li>
	<li>셀에서 고정 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS로 그들을 씻어. 추가 갓 1 x SA β-gal 얼룩 솔루션 (1.5 mL 60mm 문화 접시에서)을 준비 합니다. 건조를 방지 하 고 37 ° c.에 24 h에 대 한 그것을 품 어 파라핀 영화와 함께 요리를 봉인 또는, 습도 챔버에 함께 요리를 품 어. 참고: 통 솔루션 3% 포름알데히드를 포함 해야 합니다 수 삭제의 유해 폐기물로. CO2 없이 인큐베이터는 인큐베이션 기간 동안 pH 변화를 방지 하는 것 이다.</li>
	<li>다음 날;에 현미경으로 세포의 착 색 상태를 확인 SA β-gal-긍정적인 세포 perinuclear 지역에 파란색 표시 됩니다. 참고: proliferating 제어 셀 SA β-gal-긍정적인 세포의 낮은 주파수 표시. 경우는 얼룩 빛, 계속 약간 더 긴 기간 동안 보육 (대표 예 그림 1B 를 참조).</li>
	<li>CCD 카메라는 10 배 또는 큰 렌즈를 사용 하 여 SA β-gal 얼룩 이미지를 취득 합니다. 충분 한 수 착 색 비율을 계산 하는 이미지의 캡처 (> 200 셀).</li>
	<li>셀의 총 수를 기준으로 SA β-gal-긍정적인 세포 수를 측정 하 여 SA β-gal 얼룩진 셀의 비율을 계산 합니다. 참고: SA β-gal 얼룩 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 기반 복제 실험 (그림 1 C)의 결과에. 적절 한 셀 밀도 SA β-gal 얼룩 실험을 위해 중요 하다. 높은 confluency 노화 관련 형태에 변화를 방해 하 고 유도 제어 셀에 긍정 신호 수 있습니다.</li>
</ol>3. 측정 h 조-Ras-유도 노화 중 반응성 산소 종 유도
<ol><li>플레이트 2 x 105 WI-38 세포 60 m m 문화에 요리 하 고 1 단계에서 설명한 대로 h 조-Ras-유도 노화를 자극. 참고:이 프로토콜은 다른 유형의 세포 노화 모델에 적용할 수 있습니다.</li>
	<li>표시 된 시간 시점 (2, 4, 또는 6 일), 성장 매체를 제거 하 고 씻어 1 x PBS와 셀. 0.05 %trypsin / EDTA 용액 1 mL와 함께 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체의 1 mL을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 셀 수를 결정 합니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브로 1 x 105 셀을 전송 하 고 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>신선한 2', 7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-다) 얼룩 미디어 문화 매체 (DCF 다의 작업 농도 50 µ M)의 10 mL를 10mm DCF 다 50 µ L을 추가 하 여 준비 합니다. 참고: DCF 다 빛에 민감한입니다. 빛의 노출은 피해 야 한다. 얼룩 시간과 DCF 다의 농도 세포 유형에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에서 성장 매체를 신중 하 게 제거 하 고 갓된 DCF 다 얼룩 매체의 1 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 부정적인 얼룩 제어로 얼룩진 비 샘플을 포함 합니다. 참고: DCF 다 하지 물 확산 셀 부정적인 제어로 준비 한다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 하 고 그들을 씻어 1 x 1 x PBS의 2 mL. 1 x PBS의 1 mL로 세포를 resuspend 하 고 적절 한 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 튜브 샘플을 전송.</li>
	<li>
2 ', 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-다) 형광 신호 교류 cytometer 갖춘 적절 한 레이저 소스를 사용 하 여 측정 합니다. 블루 레이저 샘플을 자극 (488 nm) 530 ± 30 nm 검출기 (FITC) 로그 눈금을 사용 하 여 내보낸된 형광을 검출 하 고.
	<ol>
<li>먼저 비 스테인드 부정적인 제어 셀을 분석 합니다. 측면 살포 (SSC) 대 앞으로 분산형 (FSC)의 점 플롯에서 제어 도구를 사용 하 여 라이브 셀을 선택 하 고 죽은 세포 및 세포 잔해 제거. 참고: 셀 크기 변경 해야 신중 하 게 모니터링 FSC 대 SSC의 도트 음모에. 노화 세포의 크기가 크게 증가 하는 경우에, FSC 대 SSC의 도트 음모에서 게이팅 후 DCF 다 강도 같은 크기의 세포 인구에 비교 한다.</li>
		<li>DCF 다 표시 하는 단일 매개 변수 히스토그램에서 (488 nm) x의 로그 눈금에 형광-축과 y의 선형 눈금에 이벤트 (휴대폰 번호) 수-축에서 피크를 488 nm 레이저의 전압 조정 왼쪽 가장자리-스테인드 셀.</li>
		<li>DCF 다 스테인드 샘플 및 각 샘플에 대 한 기록 이상 10000 이벤트를 분석 합니다. 특정 흐름 cytometer 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플의 평균 형광 값을 취득 합니다. 참고: 선생님 측정 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균 값이 결과에서 계산 해야 합니다. 대표 h 조-Ras-유도 노화 결과 그림 2에 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantifying 일리노이-6와 노화 관련 분 비 표현 형 분석을 사용 하 여 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 대 한 IL-8 mRNA 식
<ol><li>
총 RNA 준비
	<ol>
<li>100 m m 문화에 접시 3 x 105 부-38 세포 10 %FBS 1% 페니실린/스, 포함 된 DMEM에 요리 하 고 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화를 1 일. 각 시간 지점에 대 한 중복 문화를 준비 합니다.</li>
		<li>H-RasV12 레트로 바이러스 1 단계에서 설명한 대로 셀을 감염에 의해 노화를 유도.</li>
		<li>수확 하기 전에 1 일에서 씻어 셀 2 x 1 x PBS, FBS 없이 DMEM의 3 mL를 추가. 참고:이 단계는 ELISA 단계 5에서에서 설명한 대로 사용 조건된 매체를 생산 하기 위해 실시 됩니다. 혈 청 기아 수 있습니다 일부 민감한 세포에 일리노이-6와 IL-8 mRNAs의 식을 유도 하 고 있다. 따라서, 일리노이-6와 IL-8 mRNA 식 세포와 혈 청 기아 없이 경작 한다 비교 처음. 경우 혈 청 기아 6 IL 또는 IL-8 mRNA의 표현에 상당한 변화를 유도, 정량에 대 한 총 RNA와 ELISA에 대 한 바른된 매체 대비해 야 별도로.</li>
		<li>나중 각 샘플 24 h 조건된 매체를 수집 하 고 ELISA-80 ° C에서 매체 저장.</li>
		<li>0.05 %trypsin / EDTA 용액 1 mL와 함께 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체의 1 mL을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 단계 5에서에서 설명한 대로 ELISA 결과의 정규화에 대 한 셀 수를 결정 합니다. 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리에 의해 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 수확.</li>
		<li>부드러운 흡입에 의해 매체를 제거 하 고 RNA 추출 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 다음, 소용돌이 15 microcentrifuge 튜브를 적극적으로 s. 그 후, 클로 프롬 및 적극적으로 소용돌이 다시 추가 15에 대 한 혼합물의 200 µ L을 추가 s.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 17000 x g 에서 샘플 튜브를 원심 그럼, 신중 하 게 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 상단 단계 전송. 참고:은 interphase 및 낮은 유기 단계 한다 교란 되지 새 튜브를 상위 단계의 전송 중.</li>
		<li>소 프로 파 놀 RNA 침전 하 여 부드러운 반전에 의해 잘 그들을 혼합의 400 µ L를 추가 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 실내 온도에 튜브를 품 어.</li>
		<li>17000 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 관을 원심 그런 다음 RNA 펠 릿을 유지 하도록 상쾌한을 삭제 합니다. 75% 에탄올의 1 mL을 추가 하 여 RNA를 세척 하 고 반전 튜브 2-3 배. 17000 x g 4 ° C에서 5 분에 대 한 튜브 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>실 온에서 RNA 펠 릿 건조 하 고 diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 50 µ L에서 RNA를 분해-증류수를 취급. RNA의 1 µ L를 사용 하는 분 광 광도 계와 총 RNA 농도 계량. 참고: RNA;의 용 해도 감소 시킬 것 이다 Overdrying 따라서, RNA를 overdrying 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
cDNA 준비
	<ol>
<li>얇은-벽으로 PCR 튜브에 다음을 추가 하 여 각 샘플에 대 한 반전 녹음 방송 반응 혼합물 준비: 총 RNA의 2 µ g (RNase 무료 물으로 10 µ L 볼륨 조정), RT 버퍼, 무작위 뇌관 (50 pmol), 25 x dNTP 믹스 (100의 0.8 µ L의 1 µ L x 10의 2 µ L mM), MMLV 역전사 (50 U / µ L)의 1 µ L와 5.2 µ L의 RNase 무료 물.</li>
		<li>다음 조건 열 cycler에 반전 녹음 방송 반응 프로그램 설정: 42 ° C 60 분 동안 95 ° C 5 분 장소는 PCR에 대 한 열 cycler에 시작 프로그램 관.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실시간 중 합 효소 연쇄 반응
	<ol>
<li>모든 반응에 대 한 실시간 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다. 각 샘플에 대 한 반응 혼합물은 다음과 같습니다: 실시간 PCR 주인 혼합, 1 µ L 각 6 IL 또는 IL-8에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 및 매우 순수한 증류수 (DNase 및 RNase 프리)의 21 µ L x 2의 25 µ L. 표 1을 참조 하십시오. 참고: 내부 통제로 걸 RNA 뇌관을 포함 하는 각 샘플에 대 한 실시간 PCR 반응 혼합물을 준비 합니다. GAPDH는 정규화에 대 한 내부 컨트롤로 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>96-잘 광 정량 접시에 각 잘을 48 µ L 마스터 믹스와 2 µ L의 물으로 3 희석된 cDNA 제품을 추가 합니다. 3 중 각 반응을 수행 합니다. PCR 컨트롤로 cDNA 서식 파일을 포함 하지 않는 컨트롤 잘 준비 합니다.</li>
		<li>다음 조건 열 cycler에 실시간 PCR 반응 프로그램 설정: 95 ° C, 40 사이클 of15 s 95 ° c (변성), 그리고 (어 닐 링 및 확장) 60 ° C에서 1 분에서 10 분.</li>
		<li>실시간 PCR을 수행 하 고 PCR 주기 완료 후 임계값 주기 (CT) 값을 기록 합니다. 일리노이-6 또는 IL-8 2-ΔΔCΤ 메서드가20을 사용 하 여 mRNA 레벨을 계산 합니다. 참고 다음 수식을 사용 하 여 말라 수준의 정규화 후 식에 상대 배 변화 결정 됩니다.: 접어 변화 2-Δ (ΔCT)를 = 여기, ΔCT = CT, 일리노이-6 또는 IL-8-CT, 말라; 그리고 Δ (ΔCT) =T, 자극ΔC-ΔCT, 제어.
</li>
		<li>각 중복 된 샘플에 대 한 평균 값을 계산 합니다. 참고: 정량 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 기반으로 이러한 결과에. 대표 h 조-Ras-유도 노화 결과 그림 3에 나와 있습니다. 혈 청 기아 수 있습니다 일부 민감한 세포에 일리노이-6와 IL-8 mRNAs의 식을 유도 하 고 있다. 따라서, 일리노이-6와 IL-8 mRNA 식 세포와 혈 청 기아 없이 경작 한다 비교 처음. 경우 혈 청 기아 6 IL 또는 IL-8 mRNA의 표현에 상당한 변화를 유도, 정량에 대 한 총 RNA와 ELISA에 대 한 바른된 매체 대비해 야 별도로.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 분 비 형 노화 관련 분석 ELISA를 사용 하 여 분 비 하는 일리노이-6와 IL-8 단백질의 레벨 측정
<ol><li>4 단계에서 설명한 대로 재개 조건된 매체의 3 mL 노화 WI-38 셀에서 수확. 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거 합니다.</li>
	<li>10 배 조절된 매체를 집중 원심 필터 단위를 사용 하 여 20 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 여. 참고: 조절된 매체의 농도 샘플 형식에 반드시 의존 하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>
조건 화 된 매체의 집중된 각 샘플의 50 µ L를 사용 하 여 적절 한 일리노이-6와 IL-8 ELISA 키트와 ELISA를 수행 합니다. 참고: 두 개의 ELISA 우물에 각 샘플을 테스트 합니다. 각 시간 지점 복제 되므로 4 단계에서이 분석 ELISA 분석 결과 샘플 준비 기술 모니터링을 우리가 있습니다.<ol>
<li>ELISA 플레이트 코팅에 대 한 희석 IL 6 또는 1 x PBS 0.5 µ g/mL의 농도를 가진 항 체 IL-8 일리노이-6 또는 0.125 µ g/mL에 대 한 IL-8. ELISA 격판덮개의 각 음에 희석된 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 필름을 밀봉 하는 ELISA 플레이트와 플레이트를 봉인 하 고 실 온에서 하룻밤 동요 없이 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x (0.05 %PBS 트윈-20). 각 잘을 블로킹 버퍼 (PBS에 1 %BSA)의 300 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 차단 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 표준 곡선을 생성 하기 위해 순차적으로 희석된 ELISA 희석 버퍼 (0.05% 트윈-20 및 0.1 %BSA PBS)에서 표준을 준비 합니다. 참고: 일리노이-6에 대 한 직렬 희석은 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 및 2000 pg/mL. IL-8에 대 한 직렬 희석 2.34, 4.69, 9.38, 18.75, 37.5, 75, 및 150 pg/mL 이다.</li>
		<li>각 잘을 100 µ L의 표준 솔루션 또는 샘플 솔루션 (µ 집중된 매체 50 L 희석 버퍼의 50 µ L) 100 µ L를 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 웰 스를 품 어.</li>
		<li>열망 하 여 표준 또는 샘플 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. IL-8에 대 한 IL 6 또는 0.25 µ g/ml 0.1 µ g/mL의 농도를 희석 버퍼와 탐지 항 체 희석. 잘 당 희석된 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 웰 스를 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 0.05 µ g/mL의 농도를 희석 버퍼 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 희석. 잘 당 streptavidin HRP 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실내 온도에 우물을 품 어.</li>
		<li>포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 3, 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) 기판 솔루션을 각 영역 100 µ L를 추가 합니다. 색상 개발에 대 한 수 있도록 20 분 동안 실내 온도에 우물을 품 어. 1 M HCl 정지 솔루션의 100 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
		<li>450에서 ELISA 리더와 각의 흡 광도 읽고 nm.</li>
		<li>생성 된 표준에 대 한 표준 곡선을 플롯. 표준 곡선에 따라 조건된 중간에 IL 6와 IL-8의 농도 계산 합니다. 세포 수를 정규화 한 후 결과 플롯 합니다. 중복 된 샘플에 대 한 평균 값을 계산 합니다. 참고: ELISAs 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 따라 이러한 결과 (그림 4)에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells.">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li><li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast.">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li><li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts.">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening.">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li><li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+faces+of+cellular+senescence.">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li><li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li><li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype:+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li><li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+senescent+cells+in+ageing.">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence.">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li><li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a.">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li><li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry.">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li><li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte.">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li><li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence.">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li><li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence,+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16(ink4a).">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li><li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence.">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency.">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders.">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li><li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging.">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li><li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice.">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li><li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li><li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL.">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190 (2016).</li><li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment.">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 h 조-Ras-유도 노화 동안 세포내 선생님 레벨을 모니터링 하기 위한 방법을 제시. 라이브 세포에서 세포내 선생님 수준 양적 세포 투과 시 DCF 다를 사용 하 여 측정 될 수 있다과 cytometry 합니다. 세포질 통풍 관에 DCF 다 세포내 esterases에 의해 deacetylated 이며, 형성 높은 형광 2', dichlorofluorescein (DCF)-7' 선생님에 의해 연속적으로, 산화. DCF 형광 cytometry...

50 년 이상 전, Hayflick와 무어 헤드 정상 세포 세포 분열1의 특정 번호 후 그들의 증식 잠재력의 고갈에 돌이킬 수 없는 성장 검거 입력 밝혔다. 이 현상은 이제 일차 노화 라고 고 organismal 노화2와 강하게 상관 하기 위하여 믿어진다. Telomeres의 점진적 침식 일차 노화의 주요 원인으로 간주 됩니다, 하지만 DNA 손상, 종양 활성화 및 산화 스트레스 등 다양 한 세포 스트레스 보고 되었습니다 다른 유형의 세포 노화를 유도 "조기 노화" 또는 "-스트레스로 노화" 라고합니다. 흥미롭게도, 조기 노화는 h 조-Ras와 BRAF oncogenes의 활성화에 따라 강력한 종양 진압 역할을 한다. 조직과 인간의 마우스 모델의 연구 생산 biomarkers 세포 노화의 종양 Ras와 BRAF 활성화 하지만에서 개발한 악성 암에 점감 되었다 premalignant 병 변에서 주로 존재 했다 강력한 증거 이러한 병 변3,,45. 노화 및 종양 억제의 역할을 넘어 세포 노화 상처 치유, 조직 복구, 면역 감시, 그리고 배아 개발6을 포함 하 여 다양 한 생리 적 과정에 역할을 이전 연구에 표시 되었습니다.
성장 검거 세포 노화7의 특징으로 광범위 하 게 공부 하고있다, 비록 증거의 중요 한 신체는 세포 반응성 산소 종 (선생님)도 세포 노화8에 기여 나왔다. 세포 노화, 일차 노화 및 노화 (OIS), oncogene 유도 포함 하 여 다양 한 유형의 동안 선생님 수준 상승 수십 년 전 원래 알려졌다9,10. 더 직접, H2O2 의 sublethal 복용량 exogenous 치료 노화11,12유도합니다. SOD1, 같은 선생님 청소 효소의 금지는 또한 조기 노화13발생합니다. 반면, 주변 산소 조건 낮은 선생님 청소 지연 노화10,,1415의 발병을 증가 하 고. 이러한 결과 의심할 여 지 없이 선생님은 중요 한 중재자 또는 세포 노화 유도의 결정 요인 다는 것을 나타냅니다. 그러나, 선생님 세포 노화와 세포 노화 중 선생님 레벨은 상승 하는 어떻게의 유도에 기여 하는 방법 조사 더 필요 합니다.
최근 연구는 노화 세포는 인접 세포와 SASP16,17를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 계시 했다. 세 조직에 노화 세포를 증식 세포의 자치 고갈 뿐만 아니라 SASP 통해 많은 경로 연령 관련 조직 장애를 통해 홍보. 다양 한 proinflammatory 요인, 일리노이-6와 같은 일리노이-8, TGFβ, 그리고 매트릭스 metalloproteinases (MMPs), 노화 세포에 의해 분 비 원인이 조직의 항상성, 조직 구조의 파괴의 장애를 통해 나이 관련 조직 장애 인접 셀과 살 균 염증18,19의 노화. 그러나, SASPs는 생물학 컨텍스트에 따라 유익한 효과 가질 수 있습니다. 또한, SASPs의 heterogenetic 자연 노화 세포 유형과 더 연구19에 대 한 필요성을 강조 셀 단계에 따라 달라 집니다.
여기, OIS 동안 세포내 ROS 수준을 평가 하기 위한, 빠르고 민감한 cytometry 기반 기술을 설명 합니다. 또한, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)와 ELISA를 사용 하 여 SASP 요인의 분석에 대 한 방법은 소개 했다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &amp;beta; D-galactopyranoside (X-gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>potassium ferrocyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>potassium ferricyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>trypsin-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Reverse transcriptase</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master 2x mix</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-pure distilled water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6 ELISA assay</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-8 ELISA assay</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m syringe filter</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>BEMIS&amp;nbsp;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop spectrophotometer</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>EMax microplate reader</td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative measurement of reactive oxygen species and senescence-associated secretory phenotype in normal human fibroblasts during oncogene-induced senescence

세포 노화 증식 능력 또는 다양 한 스트레스에 노출의 고갈에 따라 돌이킬 수 없는 성장 검거의 상태를 고려 하고있다. 최근 연구 개발, 상처 치유, 면역 감시 및 연령 관련 조직 장애를 포함 하 여 다양 한 생리 적 프로세스를 세포 노화의 역할을 확대 했습니다. 세포 주기 검거 세포 노화의 중요 한 특징은, 증가 된 세포내 반응 산소 종 (선생님) 생산 또한 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 또한, 최근 연구는 노화 세포 인접 세포와 노화 관련 분 비 형 (SASP)를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 전시 밝혔다. 세포 노화에 대 한 치료 전략에 대 한 관심이 급상승 노화 메커니즘, 세포내 선생님 등은 SASP의 정확한 이해를 위한 필요를 강조 한다. 여기, 우리는 양적 h 조-Ras-유도 세포 노화 선생님-민감한 형광 염료와 cytometry 사용 하 여 동안 세포내 선생님 레벨을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, mRNA 식의 유도 및 SASP 요인의 분 비의 분석을 위한 중요 한 기술을 소개합니다. 이러한 프로토콜은 다양 한 세포 노화 모델에 적용할 수 있습니다.

H 조-Ras-유도 노화의 예는 그림 1에 표시 됩니다. WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포와 H-RasV12 레트로 바이러스의 감염 유도 극적인 형태 변화 (그림 1B). 또한, 그림 1C에서 같이, SA β-gal 얼룩 활동 H RasV12 식에 따라 현저 하 게 증가 되었다. 셀의 70% 이상 보여준 SA β-gal 활동 6 d H RasV12 레트로 바이러스 감염 후...

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A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

세포내 선생님 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 여기, 우리는 세포 노화 중 선생님 수준 측정을 위한 중요 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 노화 관련 분 비 표현 형, 다양 한 연령과 관련 된 장애에 기여 하는 보도 평가 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

Oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

a-quantitative-measurement-reactive-oxygen-species-senescence

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K 조회수.  Dong-A University. 세포내 선생님 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 여기, 우리는 세포 노화 중 선생님 수준 측정을 위한 중요 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 노화 관련 분 비 표현 형, 다양 한 연령과 관련 된 장애에 기여 하는 보도 평가 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

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A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. Several cellular mechanisms, such as telomere shortening and abnormal expression of mitogenic oncogenes, have been shown to cause senescence. Senescence is not restricted to normal cells; cancer cells have also been reported to senesce.
	Chemotherapeutical drugs have been shown to induce senescence in cancer cells. However, it remains controversial whether senescence prevents or promotes tumorigenesis. As it might eventually be patient-specific, a rapid and sensitive method to assess senescence in cancer cell will soon be required.
	To this end, the standard &beta;-galactosidase assay, the currently used method, presents major drawbacks: it is time consuming and not sensitive. We propose here a flow cytometry-based assay to study senescence on live cells. This assay offers the advantage of being rapid, sensitive, and can be coupled to the immunolabeling of various cellular markers.

Whether senescence prevents or promotes tumorigenesis remains controversial. Since chemotherapeutical drugs can induce cancer cells to senesce, studying senescence is essential for proposing new therapies. However, the standard and broadly used &beta;-galactosidase assay presents major drawbacks. We propose here a rapid and sensitive flow cytometry-based assay to quantify senescence.

노화 암 세포를 정량화하는 민감한 방법

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

연구

의학

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

발생학

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

암 연구학

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge rapidly in tumor cells as a response to damage induced by various cancer treatments. Tumor cell senescence is generally considered undesirable, as senescent cells become resistant to death and block tumor remission while exacerbating tumor malignancy and treatment resistance. Therefore, the identification of senescent tumor cells is of ongoing interest to the cancer research community. Various senescence assays exist, many based on the activity of the well-known senescence marker, senescence-associated beta-galactosidase (SA-&#946;-Gal). 
Typically, the SA-&#946;-Gal assay is performed using a chromogenic substrate (X-Gal) on fixed cells, with the slow and subjective enumeration of "blue" senescent cells by light microscopy. Improved assays using cell-permeant, fluorescent SA-&#946;-Gal substrates, including C12-FDG (green) and DDAO-Galactoside (DDAOG; far-red), have enabled the analysis of living cells and allowed the use of high-throughput fluorescent analysis platforms, including flow cytometers. C12-FDG is a well-documented probe for SA-&#946;-Gal, but its green fluorescent emission overlaps with intrinsic cellular autofluorescence (AF) that arises during senescence due to the accumulation of lipofuscin aggregates. By utilizing the far-red SA-&#946;-Gal probe DDAOG, green cellular autofluorescence can be used as a secondary parameter to confirm senescence, adding reliability to the assay. The remaining fluorescence channels can be used for cell viability staining or optional fluorescent immunolabeling.
Using flow cytometry, we demonstrate the use of DDAOG and lipofuscin autofluorescence as a dual-parameter assay for the identification of senescent tumor cells. Quantitation of the percentage of viable senescent cells is performed. If desired, an optional immunolabeling step may be included to evaluate cell surface antigens of interest. Identified senescent cells can also be flow cytometrically sorted and collected for downstream analysis. Collected senescent cells can be immediately lysed (e.g., for immunoassays or 'omics analysis) or further cultured.

A protocol for fluorescent, flow cytometric quantification of senescent cancer cells induced by chemotherapy drugs in cell culture or in murine tumor models is presented. Optional procedures include co-immunostaining, sample fixation to facilitate large batch or time point analysis, and the enrichment of viable senescent cells by flow cytometric sorting.

유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

생화학

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the modification of proteins, lipids, and DNA, which finally may lead to alteration in cellular function and cell death. Therefore, it is beneficial for cells to increase their antioxidant defense in response to detrimental insults, either by activating an antioxidant pathway like Keap1/Nrf2 or by improving redox scavengers (vitamins A, C, and E, &#946;-carotene, and polyphenols, among others). Inflammation and oxidative stress are involved in the pathogenesis and progression of retinopathies, such as diabetic retinopathy (DR) and retinopathy of prematurity (ROP). Since M&#252;ller glial cells (MGCs) play a key role in the homeostasis of neural retinal tissue, they are considered an ideal model to study these cellular protective mechanisms. In this sense, quantifying ROS levels with a reproducible and simple method is essential to assess the contribution of pathways or molecules that participate in the antioxidant cell defense mechanism. In this article, we provide a complete description of the procedures required for the measurement of ROS with DCFH-DA probe and flow cytometry in MGCs. Key steps for flow cytometry data processing with the software are provided here, so the readers will be able to measure ROS levels (geometric means of FITC) and analyze fluorescence histograms. These tools are highly helpful to evaluate not only the increase in ROS after a cellular insult but also to study the antioxidant effect of certain molecules that can provide a protective effect on the cells.

Here, we propose a systematized, accessible, and reproducible protocol to detect cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in M&#252;ller glial cells (MGCs). This method quantifies total cellular ROS levels with a flow cytometer. This protocol is very easy to use, suitable, and reproducible.

뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

신경과학

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

생물학

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

기술은 유도 및 정량화 세포 노화하기

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Detecting Reactive Oxygen Species

Reactive oxygen species are chemically active, oxygen-derived molecules capable of oxidizing other molecules. Because of their reactive nature, there are many deleterious effects associated with unchecked ROS production, including structural damage to DNA and other biological molecules. However, ROS can also be mediators of physiological signaling. There is accumulating evidence that ROS play significant roles in everything from activation of transcription factors to the mediation of inflammatory toxicity that kills foreign pathogens and defend the body.In this video we will delve into the associations between ROS, metabolism and disease. After establishing their significance, we will discuss the principles and a protocol of a commonly used methodology for measuring ROS levels in cells: the use of non-fluorescent probes that become fluorescent upon oxidation. Lastly, we will review some current applications of this technique in cell biology research.

Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress

반응성 산소 종 감지

Reactive oxygen species are chemically active, oxygen-derived molecules capable of oxidizing other molecules. Because of their reactive nature, there are ...