저자는 그들의 중요 한 독서에 대 한 여기에 설명 된 방법 및 G. Gagliardi M. Garita의 설치 하는 동안 그들의 입력에 대 한 Goureau의 팀의 일원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 ANR에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), 망막 프랑스 협회와 기술 이전 회사 SATT Lutech. 그것은 또한 Investissements d'Avenir 프로그램 (ANR-11-IDEX-0004-02) 내에서 ANR에서 지 원하는 LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65)의 프레임에서 수행 되었다.

이 문서에 설명 된 프로토콜 인 라 드 비전의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 인 드 라 비전 현재 프랑스 규칙에 따르면 인간의 표본 조작을 허용 되었습니다. 표본 처리는 "위원회 회의 드 보호 des Personnes (CPP) Ile-de-France V의" 윤리적인 승인 후 헬싱키의 신조에 따라 환자 데이터 보호 및 국가 규정을 따른다.
1입니다. 문화 미디어 및 요리 준비
<ol><li>
문화 미디어
	<ol>
<li>IPSC 매체, 피더 무료 조건16pluripotent 줄기 세포 문화에 전념 화학적으로 정의 된 매체를 사용 합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 매체의 500 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>사용 기저 iPSC (Bi) 매체는 iPSC 화학적으로 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2) 또는 변형 시키는 성장 인자 Beta (TGFß) 없이 매체를 정의합니다.</li>
		<li>1% n 2 보충 (BiN2 매체), 보충 하는 양방향 매체의 500 mL를 준비, 페니실린과 스의 10 mg/mL의 10 단위/mL.</li>
		<li>Proneural n 2 기반 매체 (ProN2 매체) DMEM:Nutrient 혼합물 F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-글루타민), 1 %MEM 불필요 한 아미노산, 1% n 2 보충, 페니실린, 10 단위/mL 고 10 mg/mL 스의 구성의 500 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>Proneural B27 기반 매체 (ProB27 매체) DMEM:Nutrient 혼합물 F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-글루타민), 1 %MEM 불필요 한 아미노산의 구성 준비, 2 %B27 보충, 페니실린의 10 단위/mL와 10 mg/mL의 스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 선박 준비
	<ol>
<li>
인간의 iPSC 문화에 대 한
		<ol>
<li>1 x PBS에 vitronectin의 5 μ g/mL를 포함 하는 vitronectin 솔루션의 10 mL를 준비 합니다. 1 x PBS의 10 ml, 해 동된 vitronectin 재고 솔루션 (100 x) 100 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>0.5 µ g/c m2에 해당 하는 6 cm 문화 접시 당 vitronectin 솔루션의 2 개 mL를 배포 합니다. 실 온 (RT)에서 1 시간을 위해 그것을 품 어. 포부 진공 포부 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 vitronectin 솔루션을 제거 합니다.</li>
			<li>6 cm 접시 당 iPSC 매체의 4 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>사용 하기 전에 30 분의 최소 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서 요리를 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>IPSC 파생 RPE (hiRPE) 세포 문화에 대 한</li>
		<li>만능 줄기 세포 자격 매트릭스 또는 기판에 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 웰 스 코트. 충분 한 매트릭스 또는 기판 전체 성장 표면 영역을 커버를 추가 합니다. 예를 들어 잘 24-잘 접시와 T-25 cm2 플라스 크에 매트릭스의 3 mL 당 매트릭스의 300 µ L를 넣어.</li>
		<li>37 ° c.에서 1 h의 최소 코팅된 문화 혈관을 품 어 진공 흡입 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 매트릭스를 제거 합니다.</li>
		<li>24-잘 접시에 잘 당 ProN2 매체의 1 mL을 추가 하 고 따뜻하고 매체 equilibrate 30 분의 최소 인큐베이터에 문화 선박을 반환 합니다. T-25 cm2 플라스 크, 단계 5.2 참조.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 유지 보수 및 확장의 인간의 Ipsc
<ol><li>
인간의 Ipsc의 유지 보수
	<ol>
<li>15 mL 튜브에서 iPSC 매체의 3 mL를 준비 하 고 사용 하기 전에 15 분의 최소 RT에서 그것을 유지. 1.2.1에 설명 된 대로 코팅된 6 cm 접시를 준비 합니다.</li>
		<li>액체 질소 탱크 나는-150 ° C 냉동 고에서 인간의 Ipsc의 극저온 샘플 30 37 ° C에서 물 욕조에 부 화에 의해 해 동 s.</li>
		<li>신중 하 게 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 저온 유리병 소독. 실시간에서 미리 예 열 하는 iPSC 매체의 3 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에는 cryotube에서 해 동된 인간의 Ipsc를 전송</li>
		<li>원심 분리기 튜브 110 x g에서 3 분에 대 한 포부는 진공 포부 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>IPSC 2 mL 피 펫을 사용 하 여 6 cm 문화 vitronectin 코팅 접시에서 매체의 1 mL와 함께 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 다시 접시에 셀을 전송. 매체를 변경 하기 전에 최소 24 시간에서 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 참고: 10 µ M에 Y-27632 등 록 억제제 apoptosis를 줄이기 위해 6 cm 문화 요리에서 iPSC 매체에 추가할 수 있습니다.</li>
		<li>매일 매체를 변경 하 고 통과 인간의 Ipsc 매주.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간의 Ipsc의 뿌리고
	<ol>
<li>고전적인 7 일 후에 문화는 70-80% 합류에 인간의 iPSC를 전달 합니다.</li>
		<li>1.2.1 단계에서 설명한 대로 뿌리고 6 cm 요리 준비. Confluent Ipsc와 요리에서 iPSC 매체를 제거 하 고 실시간에서 6 분 분리 솔루션의 2 개 mL를 추가 참고: 보육 시간 iPSC 클론에 따라 달라 집니다. 시작으로 6 분 외피를 보십시오.</li>
		<li>진공 흡입 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 분리 솔루션을 제거 하 고 iPSC 매체의 2 mL 미리 따뜻하게 실시간 Resuspend에서 iPSC 식민지 1000 µ L 피 펫과 그들을 5-10 x 위아래로 pipetting 추가. 주의: 과도 한 pipetting에서 단일 셀 분리를 하지 마십시오.</li>
		<li>새로운 6 cm 문화 접시에 resuspended 세포 덩어리의 30 ~ 200 µ L를 전송 합니다. 매체를 변경 하기 전에 최소 24 시간에서 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 참고: resuspended 셀 덩어리를 뿌리고에 필요한 양의 iPSC 클론에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>매일 매체를 변경 하 고 통과 인간의 Ipsc 매주.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 망막 Organoids 세대
<ol><li>그림 1A 에서 도식화 식민지 60-70% 합류 (그림 1B)에 도달 하는 프로토콜에 따라 iPSC 차별화를 시작 합니다.</li>
	<li>6 cm 접시 당 Bi 매체의 4 mL를 준비 합니다. 37 ° c 양방향 매체를 따뜻한 쌍방향 매체 iPSC 매체를 변경 합니다. 0 (D0)로이 시간 note</li>
	<li>D2, 스위치 문화 Bi 매체에 BiN2 중간, 37 ° c.에 이전 예 열 모든 2-3 일 매체를 변경 합니다.</li>
	<li>그림 1C 와 같이 긴급 자체 형성 망막 organoids neuroepithelium 싹에 의해 식별 -1E. 참고:이 초기 망막 organoids, 시 컵에 그들의 발달 단계에서 해당 수동으로 다운스트림 실험에 대 한 격리 수 있습니다.</li>
</ol>4입니다. 망막 Organoids의 성숙
<ol><li>D28에서 6 잘 플레이트 포함 ProB27 매체 10 ng/mL FGF2의 처음 보충의 4 mL/잘 준비 (그림 1A). 참고: 추가 FGF2 즉시 미디어 판에 추가 됩니다. 주의: FGF2 필터링 하지 않습니다.</li>
	<li>6 cm 요리에서 망막 구조를 수동으로 복구 합니다. 이렇게 하려면 그림 1E, 같이 neuroepithelial 새싹 주위 바늘 수직 강선을 만드는 구조를 분리 하 고 부드럽게 바늘 긁는 organoids을 분리 합니다.</li>
	<li>10-15 organoids 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 ProB27 매체를 포함 하는 6 잘 플레이트의 단일 우물에 그들을 전송.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 셀 문화 인큐베이터에서 ProB27 매체에 부동 문화 조건에서 망막 organoids를 유지. 매체의 2-3 일 마다 변경 합니다. 참고: D35까지 FGF2와 organoids을 취급 합니다.</li>
	<li>D35에 매체의 절반을 제거 하 고 신선한 prewarmed ProB27 매체 FGF2 없이 37 ° C에 추가.</li>
	<li>매체의 절반 그림 2에서 같이 망막 세포 유형의 출현에 따라 원하는 망막 세포 유형 얻을 하는 데 필요한 시간 동안 2-3 일 마다 변경 합니다.</li>
</ol>5. 세대 및 증폭의 인간의 iPSC 파생 RPE (hiRPE) 셀
<ol><li>
인간 hiRPE 세포의 생성
	<ol>
<li>차별화에 관여는 Ipsc 식민지 그림 3A에서도식화 하는 프로토콜에 따라 60-70%의 합류를 도달할 때.</li>
		<li>쌍방향 매체의 6 cm 접시 당 4 mL를 준비 하 고 37 ° c.에 양방향 매체를 따뜻한 쌍방향 매체 iPSC 매체를 변경 합니다. 0 (D0)로이 시간 note</li>
		<li>D2, 스위치 문화 Bi 매체에 이전 37 ° c.에 따뜻하게 BiN2 매체에 모든 2-3 일 매체를 변경 합니다.</li>
		<li>D28에 이전 그림 3A에서 같이 37 ° C에서 예 열 신선한 ProN2 매체에 매체를 변경 합니다. 참고:이 단계는 4 단계에서 설명한 organoid 따기 후 해질 수 있다.</li>
		<li>2-3 일 마다 ProN2 매체를 변경 합니다.</li>
		<li>그림 3B에서와 같이 D42에서 안료 패치의 관측에 의해 긴급 hiRPE 세포를 식별 합니다. 참고: hiRPE 세포의 염색 D35 iPSC 클론에 따라 D56 사이 나타납니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE 세포의 증폭
	<ol>
<li>D42에 이전 단계 1.2.2에서에서 설명한 대로 매트릭스와 코팅 잘 당 ProN2 매체의 1 mL를 포함 하는 24-잘 접시를 준비 합니다. 사용 하기 전에 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 15 분 동안 접시를 놓습니다.</li>
		<li>6 cm 접시에서 hiRPE 패치를 수동으로 복구 합니다. 패치를 격리 하려면 안료 상피 주위 바늘 수직 줄무늬를 확인 하 고 부드럽게 바늘 긁 적 하 여 시트를 분리 합니다. 10 안료 패치 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 24-잘 접시의 단일 우물에 그들을 전송.</li>
		<li>매체를 변경 하기 전에 ProN2 매체는 셀 문화 인큐베이터에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 hiRPE 패치 하십시오. 0 (hiRPEp0)으로이 hiRPE 셀 통로 note. 매체 ProN2 매체와 2-3 일 마다 변경 합니다.</li>
		<li>셀 confluent 때 hiRPEp0 세포를 전달 합니다.<ol>
<li>진공 흡입 시스템을 사용 하 여 매체를 제거 하 고 각 잘 1 x 5 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS의 1 mL로 씻어.</li>
			<li>진공 흡입 시스템을 사용 하 여 PBS를 버리고 0.25 %trypsin 당 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 15 분의 최소 그것을 품 어 비활성화 된 트립 신을 ProB27 매체의 800 µ L를 추가 합니다. 참고: 트립 신 활동을 ProN2 매체의 사용이 권장 하지 않습니다.</li>
			<li>HiRPE 셀의 위쪽 및 아래쪽 pipetting으로 해리. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 놓고 110 x g에 5 분 동안 원심. 참고: ProN2 매체 ProB27 매체의 초과 제거 하는 추가 세척을 할 수 있습니다.</li>
			<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 37 ° c.에 미리 예 열 ProN2 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend 셀 카운터로 셀을 계산 합니다.</li>
			<li>1.25 백만 셀 하 고 매트릭스 코팅 T-25 cm2 플라스 크에 넣어 (단계 2.2.2 참조) 37 ° c.에 미리 따뜻하게 ProN2 매체의 5 mL를 포함 하 1 (hiRPEp1)로이 hiRPE 셀 통로 note.</li>
		</ol>
</li>
		<li>계속 hiRPE 셀 셀 문화 인큐베이터에서 ProN2 매체에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 매체를 변경 하기 전에.</li>
		<li>2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. HiRPEp1 셀 합류에 도달, 다음 통로 또는 cryopreservation 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 망막 Organoids 및 hiRPE 셀의 cryopreservation
<ol><li>
전체 망막 organoids에 대 한
	<ol>
<li>5 ~ 20 망막 organoids 전송 피펫으로 사용 하 여 선택 하 고 극저온 유리병에 넣어. 튜브의 하단에 organoids를 건드리지 않고 1000 µ L 피 펫과 초과 모든 매체를 제거 하 고 차가운 cryopreservation 매체의 250 µ L 추가 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>고정 4 h. 전송의 최소-80 ° C에서 소 프로 파 놀 기반 냉동 컨테이너에서 튜브-150 ° C 냉장고 또는 액체 질소 탱크 장기 저장을 위해 냉동된 튜브.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE 셀에 대 한
	<ol>
<li>통로 1에 셀 confluent 때 hiRPE 세포 분열. 참고: hiRPEp0 셀의 cryopreservation 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>T-25 cm2 플라스 크 진공 포부 시스템을 사용 하 여에서 중간 발음 하 고 그것을 씻어 5 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS의 3 mL 1 x.</li>
		<li>진공 흡입 시스템을 사용 하 여 PBS를 제거, 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 15 분의 최소 그것을 품 어 트립 신 활동을 ProB27 매체의 5 mL를 추가 합니다. 참고: 비활성화 트립 신을 ProN2 매체의 사용이 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>10 mL 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 hiRPE 셀의 시트를 분리. 셀 카운터와 셀을 계산 합니다. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 놓고 110 x g에 5 분 동안 원심. 참고: 추가 세척 ProN2 매체 ProB27 매체의 초과 제거를 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>진공 포부를 사용 하 여 상쾌한 발음 하 고 부드럽게 cryopreservation 매체의 250 µ L에 2 백만 세포를 세포를 resuspend.</li>
		<li>극저온 유리병 당 세포 현 탁 액의 250 µ L를 전송 합니다. 최소 4 h-80 ° C에서 소 프로 파 놀 기반 냉동 컨테이너에 튜브를 고정 합니다.</li>
		<li>-150 ° C 냉동 고 또는 장기 저장을 위한 액체 질소 탱크에 냉동된 튜브를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 해빙 망막 Organoids 및 hiRPE 세포의
<ol><li>
전체 망막 organoids의 해빙
	<ol>
<li>37 ° C에서 따뜻한 ProB27 매체 (2 mL 각 극저온 유리병에 필요한 것).</li>
		<li>액체 질소 탱크 또는-150 ° C 냉장고에서 저온 유리병 포함 37 ° C에서 물 욕조에 망막 organoids 30 s. 소독 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 신중 하 게 저온 유리병을 녹여.</li>
		<li>유리병을 열고 미리 데워 진된 ProB27 매체의 1 mL를 추가 합니다. 전송 피 펫 1.5 mL 튜브에는 organoids를 전송.</li>
		<li>튜브의 하단에 망막 구조를 건드리지 않고 pipetting으로 매체를 부드럽게 제거 합니다. 워시는 organoids 1 1 mL와 함께 더 많은 시간 미리 데워 진된 ProB27 매체의.</li>
		<li>전송 피펫으로와 organoids를 발음 하 고 미리 예 열 하 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에 equilibrated ProB27 매체를 포함 하는 6-잘 접시의 1에 넣어. 참고: 6 잘 플레이트의 당 10-15 망막 organoids를 배치 합니다.</li>
		<li>매체의 절반 그림 2에 설명 된 대로 그들의 출현에 따라 원하는 망막 세포 유형 얻을 하는 데 필요한 시간 동안 2-3 일 마다 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE 셀의 해빙
	<ol>
<li>37 ° C에서 따뜻한 ProN2 매체 (8 mL 각 극저온 유리병에 필요한 것).</li>
		<li>액체 질소 탱크 또는-150 ° C 냉장고에서 해 동 hiRPEp1 세포의 극저온 샘플 37 ° C에 물 목욕으로 외피에 의해 30 s. 소독에 대 한 신중 하 게 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 저온 유리병.</li>
		<li>튜브를 열고 미리 데워 진된 ProN2 매체의 1 mL를 추가 하 고 미리 데워 진된 ProN2 매체의 2 개 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 110 x g에 5 분 동안 원심.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 37 ° c.에 미리 예 열 ProN2 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend</li>
		<li>셀 카운터로 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>1.25 백만 셀 하 고 매트릭스 코팅 T-25 cm2 플라스 크에 넣어 (단계 2.2.2 참조) 37 ° c.에 미리 따뜻하게 ProN2 매체의 5 mL를 포함 하 이 단계에서 2 (hiRPEp2) 통로 note.</li>
		<li>계속 hiRPEp2 셀 셀 문화 인큐베이터에서 ProN2 매체에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 매체를 변경 하기 전에.</li>
		<li>2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. HiRPE 셀 합류에 도달, 다음 통로 또는 cryopreservation 수행 합니다. 참고: 2 주 후에 문화, 8-10 백만 hiRPE 셀 추가 실험에 대 한 수집할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Reichman, S., Slembrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+ips+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).</li>
<li>Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8, 424-429 (2011).</li>
<li>Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibition+extends+passage+of+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).</li>
</ol>

Sacha Reichman, 올리비에 Goureau, 그리고 호세 알랭 Sahel 중인 인간 만능 줄기 세포에서 망막 세포의 생성에 관련 된 특허 발명에 있습니다.

이 프로토콜 RPE 세포 및 망막 organoids, 망막 RGCs 및 대뇌, 이종와 피더 조건에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 방법을 설명 합니다. 여기 좋은 제조 관행 (GMP) 과정, 재배 하는 방법 호환 RPE 세포, RGCs, 그리고 줄기 세포 기반 요법 및 약물의 개발에 대 한 대뇌 iPSC 파생 된 망막 세포의 큰 생산 수 발견은 망막 퇴행 성 질환의 미래 처리를 위한 접근 한다. 전체 망막 organoids 또는 hiRPE 셀의 cryo...

망막 중앙 신경 시스템 (CNS)의 중요 한 부분이 이며 자발적으로 외상 성 부상이 나 질병에 따라 다시 생성 제한 된 용량을 하고있다. 따라서, 연령 관련 황 반 변성 (AMD), 망막 화 (RP), 녹 내장, 당뇨병 성 망막 증 등 확실 한 망막 세포 손실의 원인이 퇴행 성 병 리는 일반적으로 돌이킬 수 없는 실명으로 이어질. 퇴 화 된 망막 구조를 손상 또는 분실 된 세포를 대체 하는 것을 목표로 하는 줄기 세포 기반 요법 가장 유망한 접근1,,23중 하나는 주요 도전 이다. 인간 배아 줄기 세포 (ESCs) 세포로 만능 줄기 세포 또는 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 문화, 무한정 확장 될 수 있고 그들은 모든 종류를 생산 하는 잠재력을가지고. 망막 개발에 대 한 우리의 이해에 생체 외에서 의 개선 발전 인간의 iPSC 차별화 망막 organoids7,,89의 세대에서 결과 대 한 프로토콜 10,,1112. 망막 신경 절 세포 (RGCs), 대뇌, 그리고 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 포함 하 여 주요 망막 세포의 모든 인간의 ESCs와 Ipsc4,5, 에서 성공적으로 분화 된 6. Eiraku 그 외 여러분 에 의해 개발 된 SFEB (embryoid 몸 같은 집계의 혈 청 무료 문화) 방법에 따라 13, 망막 organoids의 자기 형성 ESC 또는 iPSC 파생 embryoid 몸 같은 집계 정의 된 세포 외 매트릭스 구성 요소7,10,14에서 얻을 수 있습니다. 하지만 이러한 프로토콜 치료 접근 또는 약물 검사에 대 한 많은 호환 되지 않습니다 항상 셀의 큰 생산 단계를 요구 하는 복잡 한. 따라서, 인간의 망막 세포를 생산 하는 방법의 선택이 중요 하 고 메서드가 확장 가능한, 강력 하 고 효율적인 필요.
우리 우리의 이전 게시15을 기반으로, 여기, 부착 인간의 Ipsc 급지대와 이종 조건에 재배에서 망막 organoid 자기 형성을 통해 망막 세포의 간단 하 고 효율적인 생성에 대 한 각 단계 설명 해 서. 부착 인간의 Ipsc의 일상적인 문화에서 시작 해 서,이 프로토콜만 간단한 연속 매체 4 주에 iPS 파생 RPE (hiRPE) 세포와 neuroretinal 구조 둘 다의 생성을 허용 하도록 변경 해야 합니다. 수동 격리 후 hiRPE를 확장할 수 있습니다. 있으며 망막 구조 망막 조상 세포 vivo에서 인간 일치 순차적으로 모든 망막 세포 유형으로 분화 할 수 있는 organoids를 부동으로 경작 될 수 있습니다. retinogenesis입니다. 마지막으로, 연구 발전 또는 임상 번역, 우리 그들의 phenotypic 특성 및 기능에 영향을 주지 않고 전체 망막 organoids 및 hiRPE 세포의 장기 저장 수 cryopreservation 메서드를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14700</td><td>Coating</td></tr><tr><td>CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A27940</td><td>Coating</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>medium</td></tr><tr><td>Essential 6 Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1516401</td><td>medium</td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1370701</td><td>supplement CTS</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td>supplement</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td>supplement</td></tr><tr><td>CTS B-27 Supplement, XenoFree</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1486701</td><td>supplement CTS</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320074</td><td>medium</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140035</td><td>supplement</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>antibiotic</td></tr><tr><td>CellStart CTS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1014201</td><td>Matrix CTS</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1569601</td><td>Matrix</td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>dissociation solution</td></tr><tr><td>Cryostem Freezing Media</td><td>clinisciences</td><td>05-710-1D</td><td>Cryopreservation medium</td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td><td>Preprotech</td><td>100-18B</td><td>FGF2</td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free</td><td>Preprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>FGF2 Xeno free</td></tr><tr><td>AGANI needle 23G</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td>Needle</td></tr><tr><td>Flask 25 cm&amp;sup2; Tissue Culture Treated</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td>T-25 cm&amp;sup2;</td></tr><tr><td>24 well plate Tissue Culture Treated</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>24-well plate</td></tr><tr><td>6 well plate Tissue Culture Treated</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>6-well plate</td></tr></tbody></table>

defined xeno-free and feeder-free culture conditions for the generation of human ipsc-derived retinal cell models

만능 줄기 세포에서 특수 세포의 생산 재생 의학에 대 한 새로운 접근을 개발 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 사용은 어디 iPSC 파생 된 망막 세포 모델 이해 하 고 실명을 싸울 중요 한 단계를 앞으로 표시 neurodegenerative 질병 연구, 망막 dystrophies를 포함 하 여 특히 매력적 이다. 이 논문에서는, 우리 생성, 성숙, 망막 organoids cryopreserve을 간단 하 고 확장 가능한 프로토콜을 설명 합니다. 변화 하는 매체에 따라,이 방법의 주요 장점은 여러 방지 이며 Ipsc의 가이드 차별화에 필요한 일반적으로 시간이 많이 걸리는 단계. 부착 인간의 iPSC 문화에 정의 된 미디어의 연속적인 변화에 의해 망막 개발의 초기 단계를 흉내 낸,이 프로토콜 자체 neuroretinal 구조에 망막 안료 상피 (RPE) 세포 형성의 동시 발생을 사용 하는 4 주에 재현 하 고 효율적인 방식 으로입니다. 성인 인간의 망막에 7 망막 세포 유형으로 Rpc의 차별화를 활성화 부동 문화 상태에서 더 성숙 망막 조상 세포 (Rpc)을 포함 하는 이러한 구조 쉽게 격리 될 수 있습니다. 또한, 우리 망막 organoids의 cryopreservation 빠른 방법 및 RPE 세포 장기 저장에 대 한 설명합니다. 함께 결합, 여기에 설명 된 방법을 생산 하 고 인간의 iPSC 파생 된 망막 세포 또는 조직 모두 기본 및 임상 연구에 대 한 은행 유용 있을 것입니다.

급지대 무료 조건16 에서 인간의 iPSC 차별화에 대 한 첫 번째 단계는 자기 갱신 기계 자발적인 차별화 (그림 1A)를 장려 하기 위해 양방향 매체를 사용 하 여 종료입니다. 다음, Bi 매체 보완에 D2, 신경 및 망막 혈통으로 차별화 Ipsc 셀 가이드는 N2 보완. 이 프로세스 리드 D28 주위에 neuroretinal 꽃 봉 오리의 모습 (그림 1C</st...

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Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

defined-xeno-free-feeder-free-culture-conditions-for-generation-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K 조회수.  Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France. 전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

비디오: Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

연구

발생학

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

생물학

Generation of Human Patient iPSC-derived Retinal Organoids to Model Retinitis Pigmentosa

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority of RP patients have progressive photoreceptor degeneration leading to peripheral vision loss, night blindness, and finally, total blindness. To date, thousands of mutations in more than 90 genes have been reported to be associated with RP. Currently, there are few animal models available for all the affected genes and different types of mutations, which largely hampers the deciphering of the mechanisms underlying the gene/mutation pathology and limits treatment and drug development. Patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids (ROs) have provided a better system to model the human early-onset disease than cells and animals. In order to study RP, those patient-derived 3D retinal organoids were utilized to recapitulate the clinical phenotypes of RP. In the RP patient-derived ROs, Rhodopsin mislocalization was clearly displayed. Compared with other animal models, patient iPSC-derived retinal organoid models more closely recapitulated RP features and represent an ideal approach for investigating the disease pathogenesis and for drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>색소성 망막염을 모델링하기 위한 인간 환자 iPSC 유래 망막 오가노이드 생성

In this protocol, retinitis pigmentosa patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids were generated. Those organoids successfully recapitulated some clinical phenotypes of the retinitis pigmentosa disease.

색소성 망막염을 모델링하기 위한 인간 환자 iPSC 유래 망막 오가노이드 생성

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority ...

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

인간 배아 줄기 세포에서 향상된 3D 신경 망막 분화

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

저자 스포트라이트: 질병 모델링을 위한 간단하고 효율적인 신경 망막 오가노이드 생산

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

요약

더 많은 비디오 탐색

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

색소성 망막염을 모델링하기 위한 인간 환자 iPSC 유래 망막 오가노이드 생성

색소성 망막염을 모델링하기 위한 인간 환자 iPSC 유래 망막 오가노이드 생성

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성