우리 앤 Dodson 감사와 스테파니 하인리히 smFISH 프로토콜을 최적화 하는 방법에 대 한 조언 위한 Xavier Darzacq 분석 플랫폼, Haiyan 황 통계 분석에 대 한 제안에 대 한 도움말. 이 작품은 십 센트의 3 월 (5-FY15-99), 퓨 자선 트러스트 (00027344), Damon Runyon 암 연구 재단 (35-15) 및 글렌 EÜ을 재단과 NSF 대학원 연구 장학금 부여 번호에서 자금에 의해 지원 되었다 JC에 DGE-1106400입니다.

참고: 모든 버퍼와이 프로토콜에 사용 된 미디어는 표 1에 나열 됩니다. 시 약에 대 한 공급 업체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
일 1/1-2 일:
참고: 식물 문화에 대 한 OD600 0.4에 0.6 선호 매체에서의 세포를 성장 한다. Meiotic 문화에 대 한 셀 (일반적으로 1.85의 OD600 에 경작) 기본 메서드를 사용 하 여 감수 분열을 유도.
1. 샘플 고정 및 소화
<ol><li>3% 포름알데히드에 셀의 ~3.5 OD600 의 총 수정.<ol>
<li>식물 문화에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 37% 포름알데히드의 480 µ L를 문화의 5.52 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>Meiotic 문화, 문화의 1840 µ L 2 mL microcentrifuge 튜브에 37% 포름알데히드의 160 µ L를 추가 합니다. 하 ~ 5 번 반전 혼합. 주의: 포름알데히드는 독성이 있다. 처리 하 고 기관 규정에 따라 처분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 분 동안 실내 온도에 롤러 드럼에 튜브를 놓습니다. Meiotic 샘플, 20 분 동안 실내 온도에 고정 후 하룻밤 4 ˚C에서 수정 계속, 회전. 참고: 야간 고정 meiotic 샘플 획득 smFISH 데이터의 품질과 재현성을 증가 시킵니다. 고정 시간을 최적화 합니다.</li>
	<li>샘플을 수정 하는 동안 200mm Vanadyl Ribonucleoside 복합물 (VRC) 적어도 10 분 동안 65 ˚C에서 해 동.</li>
	<li>15 mL 튜브에 소화 마스터 믹스 준비: 버퍼 b 425 µ L 200 mm (65 ˚C 하 예 열); VRC 40 µ L 믹스 1 샘플 5 샘플에 대 한 버퍼 B의 2125 µ L 200 m (65 ˚C 하 예 열) VRC m의 200 µ L 믹스. 완전히 밝은 갈색 녹색 VRC 추가 후 표시 됩니다 마스터 믹스에 추가 하기 전에 VRC resuspend을 소용돌이 ~ 5 s. 참고: 추가 VRC 소화 하는 동안 향상 됩니다 smFISH 결과의 일관성 잠재적으로 원유 추출에서 순화 zymolyase 혼합물에 의해 도입 된 nuclease 오염 억제. 이 단계에서 필요한 VRC 양의 최적화 되어야 합니다.</li>
	<li>식물 샘플에 대 일 분 ~ 1057 x g에서 튜브 원심. (후에 야간 고정) meiotic 샘플, 1.5 분 Decant 21000 x g에서 원심 또는 포름알데히드 폐기물 상쾌한 발음. 참고: 모든 원심 분리 단계는 상 온에서 수행 됩니다.</li>
	<li>아래로 pipetting 또는 튜브를 거꾸로 하 고 혼합 flicking 셀 1.5 mL 찬 버퍼 b에 resuspend. 물의 resuspension 후 2 mL 튜브에 식물 샘플을 전송.</li>
	<li>1.5 분에 대 한 21000 x g에서 원심 분리기는 액체의 대량 진공 포부에 의해 여 제거할 pipetting, ~ 100 µ L를 남겨두고.</li>
	<li>1.5 mL 찬 버퍼 b에 셀 resuspend</li>
	<li>1.5 분에 대 한 21000 x g에서 원심 분리기는 액체의 대량 진공 포부에 의해 여 제거할 pipetting, ~ 100 µ L를 남겨두고.</li>
	<li>Resuspend 셀 1.5 분 Aspirate에 대 한 21000 x g에서 차가운 버퍼 B. 분리기의 1.5 mL에 완전히 진공 또는 pipetting 액체.</li>
	<li>소화 마스터 믹스, 그리고 짧게 resuspend를 소용돌이의 425 µ L 셀 resuspend 각 튜브를 100T 10 mg/mL zymolyase의 5 µ L를 추가 합니다. 참고: 소용돌이 관에 추가 하기 전에 때마다 zymolyase Zymolyase 각 튜브를 개별적으로 추가할 마스터 믹스에 추가 하는 대신. 두 단계 zymolyase 신속 하 게 침전 물 때문에 튜브 중 소화 일관성을 유지 도움이.</li>
	<li>믹스와 2-3 동 s입니다. 롤러 드럼에 튜브를 놓고 30 ˚C 15-30 분에 소화 합니다. 식물 세포와 초기 meiotic 단계, 보통 ~ 15 분 걸립니다 그리고 meiotic 의향 및 meiotic 사단, 보통 ~ 30 분 걸립니다. 참고: 15 분 후 현미경에 매 5 분을 확인 하 고 세포의 ~ 80% 비-투명 하 고 비 굴절 나타나면 소화를 중지. 가이 시점에서 세포는 매우 깨지기 쉬운. 셀을 부드럽게 처리 하 고 진공 포부 또는 vortexing를 사용 하지 마십시오.
</li>
	<li>원심 ~ 376 x g 3 분 제거에서 튜브 액체 완전히 pipetting으로.</li>
	<li>부드럽게 버퍼 B의 1 mL로 세포를 1-2 번 아래로 pipetting으로 resuspend 혼합.</li>
	<li>Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거 버퍼 B 액체에 튜브를 원심. 부드럽게 70% 에탄올 (RNase 무료 물과 함께 희석) 1 mL에 셀 resuspend.</li>
	<li>3.5-4 시간 동안 실 온에서 품 어.</li>
</ol>2입니다. 교 잡
<ol><li>실내 온도에 formamide를가지고 (50 mL 약 수에 대 한 걸리는 ~ 30 분 물 목욕에서). 참고: 병 formamide의 산화 방지를 위해 상 온에 도달할 때까지 formamide 병을 열지 마십시오. 주의: Formamide은 독성이 있습니다. 처리 하 고 기관 규정에 따라 처분.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 10 %formamide 워시 버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거 500 µ L의 70% 에탄올에 튜브를 원심. 부드럽게 피펫으로 아래로 나머지 셀 resuspend를 다음 낮은 접착 튜브 셀을 전송. 참고: 다음 세척 시 셀 손실 감소 크게 낮은 접착 튜브를 사용 하 여.</li>
	<li>Pipetting으로 ~ 376 x g 3 분 제거에서 다시 튜브 모든 에탄올을 원심.</li>
	<li>추가 10 %formamide 워시 버퍼, 그리고 부드럽게 피펫으로의 1 mL를 위아래로 2-3 시간 하 셀 resuspend.</li>
	<li>하이브리드 솔루션을 준비 하는 동안 ~ 20 분 동안 실내 온도에 앉아 셀 수 있습니다. 1 샘플에 대 한 교 잡 버퍼 (임시 방)의 50 µ L, 200 mm (65 ˚C 하 예 열), VRC 5 µ L 및 각 프로브 (200 nM 최종)의 1 µ L를 혼합. 5 샘플에 대 한 교 잡 버퍼 (임시 방)의 250 µ L, 200 mm (65 ˚C 하 예 열), VRC 25 µ L 및 각 프로브 (200 nM 최종)의 5 µ L를 혼합.<ol>
<li>Formamide 산화를 방지 하기 위해 튜브를 열기 전에 실내 온도 (-20 ˚C에서 냉동) 교 잡 버퍼를 녹여.</li>
		<li>200mm VRC, 프로브를 추가 하기 전에 5-10 s에 대 한 소용돌이 추가한 후에 설계 상업적으로, 구입 그리고 제조업체의 지침에 따라 재구성.</li>
		<li>2 프로브 공동 incubated 있다면, 추가 1시 10분의 1 µ L 프로브 #1 주식으로 1시 10분의 1 µ L의 희석의 최종 희석 수 있도록 프로브 #2 주식의 희석 ~ 어느 프로브에 대 한 1: 500. 최상의 신호 대 잡음 비율 요구에 필요한 농도 최적화 (자세한 내용은 토론 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 유해 폐기물에 pipetting으로.</li>
	<li>각 튜브를 교 잡 솔루션의 적어도 50 µ L를 추가 합니다. 믹스에 튜브를 터치 합니다.</li>
	<li>어둠 속에서 적어도 16 시간 동안 롤러 드럼에 30 ˚C에서 품 어.</li>
</ol>주 2/3 일
3. 세척 및 이미징
<ol><li>실내 온도에 formamide를가지고.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 10 %formamide 워시 버퍼 (FWB)를 준비 합니다.</li>
	<li>롤러 드럼에서 튜브를 제거 하 고 빛 으로부터 보호 하기 위해 호 일 커버 상자에 그들을 배치.</li>
	<li>원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 유해 폐기물에 pipetting으로.</li>
	<li>부드럽게 위아래로 pipetting으로 10 %FWB 1 mL에 resuspend 번 2-3.</li>
	<li>30 분 (회전 하지) 호 적용 상자에서 30 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>3 분 pipetting, 상쾌한 유해 폐기물을 제거에 대 한 샘플 ~ 376 x g에서 원심 고 ~ 50 µ L를 둡니다.</li>
	<li>한편, 15 mL 원뿔 튜브에 DAPI/FWB 준비: 1 샘플, 5 mg/ml DAPI 1 µ L 1000 µ L 10 %formamide 워시 버퍼의 혼합. 10 샘플, 5 mg/ml DAPI 10 µ L로 10 %formamide 워시 버퍼의 10 mL를 섞는다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 DAPI/FWB의 1 mL에 resuspend 번 2-3.</li>
	<li>30 분 (회전 하지) 호 적용 상자에서 30 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>안티 표 백제 시 약 얼음에 녹여</li>
	<li>원심에서 ~ 376 x g 3 분 제거에 대 한 샘플은 상쾌한 완전히 pipetting으로. 필요한 경우, 모두는 상쾌한 제거 하려면 다시 원심.</li>
	<li>즉시 이미지는 샘플에 대 한 GLOX 버퍼 없이 효소의 50 µ L에 펠 릿을 resuspend. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 3-4 회를 섞어.<ol>
<li>모든 unimaged 샘플 호 적용 상자에서 4 ˚C에까지 계속 준비 이미지. 이미지를 준비, 2 분 ~ 376 x g에서 샘플 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 완전히 제거 하는 방법. 아래와 같은 효소 GLOX에 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플에 대 한 즉시, 몇 군데 되 고 효소 GLOX 버퍼의 15-20 µ L을 추가 합니다. 부드럽게 피펫으로 위아래를 섞어입니다. 참고: 볼륨 추가 셀 펠 릿의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 우리 효소 GLOX 버퍼의 15 µ L에 펠 릿을 resuspending 하는 것을 권장 하 고 현미경에 셀 밀도 확인 합니다. 세포는 너무 조밀한 (세포 서로 응집), 효소 추가 GLOX 버퍼를 추가 합니다. 셀 너무 스파스 있다면, 원심 샘플 하 고 버퍼의 ~ 5 µ L을 제거 합니다.</li>
	<li>피펫으로 5 µ L coverslip (18 m m x 18 m m, 제 1 호), 그리고 넣어 슬라이드에 coverslip에.</li>
	<li>넣어 슬라이드 위에 실험실 지우기는 coverslip 배치 됩니다. 부드럽게 슬라이드 (액체는 coverslip의 모든 4 개의 가장자리에서 빼야 보아야 한다)를 설정 하는 실험실 지우기에 누릅니다.</li>
	<li>알루미늄 호 일에 의해 포함 하는 상자에 현미경을 슬라이드를 전송 합니다.</li>
	<li>이미지 와이드 필드 형광 현미경을 사용 하 여 높은 확대 (60-100 X)와 높은 수 가늠 구멍. 참고: smFISH 프로브에 의해 방출 되는 광자의 최대 수를 수집, confocal 현미경 권장 하지 않습니다, 그들은 크게 수집 빛의 양을 제한으로. 여기, 데이터 수집 했다 100 X, 1.4 나 목표를 갖춘 현미경에 CY5 필터를 사용 하 여 (EX632/22, EM679/34) 1.3에서 몇 군데 s, 100 %T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100 %T; 그리고 DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, 32%-50 %t. 밝은 필드 참조 이미지 또한 취득 한다. 0.1-0.2의 스텝 크기와 15-25 조각 취득 µ m에서 전적으로 전적으로 위, 보기의 필드의 초점 아래 있도록 그의 모든 RNA 명소는 차지 했다.</li>
</ol>4. 이미지 분석
<ol><li>물고기-양의17 , StarSearch2, 등 게시 된 smFISH 분석 도구 또는 실험의 정확한 요구 사항에 따라 맞춤 프로그램, smFISH 데이터를 분석 합니다. 참고: 좋은 분석 파이프라인 진정한 RNA 명소는 배경에서 분리 하 고 X, Y 및 Z (옵션) 좌표와 각 자리, 각 셀에 관광 명소의 수의 강도 등의 통계를 출력 하는 임계값을 확인 하려면 사용자를 허용 해야 합니다. 그리고 아마도 거짓 탐지를 필터링 하는 방법으로 매개 변수를 피팅.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. 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저자는 공개 충돌의 관심 있다.

여기에 제시 된 프로토콜 다른 게시 된 smFISH 프로토콜2,3,21,,2223에서 파생 되 고 효 모 스트레인 배경 SK1 최적화입니다. 최적화 된 매개 변수 셀 번호, 고정 기간, 원심 분리 속도 기간, 소화 기간, 소화 버퍼, 프로브 농도 및 교 잡 버퍼 포함. 교 잡 온도 기간 같은 다른 매개 변수 최적화 하지 했다. 이 섹션에서 우리는이 프로토콜 어떤 효 모 스트레인 배경 및 관심사의 성장 조건에 적응 하는 데 도움이 될 몇 가지 메모를 공유.
싹 트는 효 모의 세포 벽은 프로브 삽입을 방지 하는 세포 벽 때문에 싹 트는 효 모에 높은-품질 smFISH 이미지를 획득 하는 것에 대 한 하나의 주요 도전 이다. Zymolyase에 의해 세포 벽의 불완전 한 소화는 프로브와 신호에 높은 셀 다양성의 비효율적인 교 잡 이끌어 낸다. 그러나, 이상의 소화 수 셀 너무 연약 할 중요 한 선도 세척 단계 동안 손실 셀 및 셀 이미징에 대 한 슬라이드 준비 중 붕괴. 따라서, 소화 기간 최적화 매우 중요입니다. 서로 다른 양의 시간에 대 한 동일한 샘플을 소화 하 여 파일럿 smFISH 실험을 실시 하는 것이 좋습니다. 우리의 경우, 우리 최고의 smFISH 데이터를 얻은 하는 셀의 ~ 80%가 비 굴절 될 때 우리가 소화 중지. 일반적으로, 동일한 성장 조건에 대 한 다른 유전자 돌연변이 체 긴장 비슷한 타이밍으로 소화 될 수 있습니다. 그러나, 소화 기간 다른 성장 조건 및 싹 트는 효 모에 감수 분열의 다른 단계 사이에서 비교 될 때 다릅니다. 타이밍 결정 되 면 smFISH의 품질이 재현 합니다. 참고 결함 세포 벽 합성 또는 구성 돌연변이 체 긴장에 대 한 소화 zymolyase의 다른 배치의 사용 미만 15 분 내에 완료 될 수 있습니다 또한 약간 소화 타이밍을 변경할 수 있습니다.
최적의 프로브 농도 높은 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 필요 합니다. 우리가 설계 하 고 상업적으로 우리의 smFISH 프로브를 구입. 좋은 프로브 (종종 20-메) GC 35%에서 45%, 프로브, 그리고 낮은 분 사이 2 기본적인 쌍의 최소 간격 사이의 비율을 가져야 한다. 우리 프로브, 목록을 생성 하는 제조 업체에서 웹 기반 조사 디자이너를 사용 하 고 충분 한 프로브에서 선택할 수 있다면, 우리는 알고리즘을 사용 폭발 Saccharomyces 게놈 데이터베이스에서 이상의 17 자료 쌍 겹쳐 프로브를 제거 하 과 다른 게놈 영역입니다. 우리는 더 많은 photostable 형광 염료 (CAL Fluor 590) 때문에이 세트에서 (20 프로브) 위의 기준을 모두 만족 하는 프로브 수 보다 낮은 NDC80luti (CF 590)의 독특한 영역에 anneals 프로브 세트에 대 한 선택은 (~ 25 프로브) 제조업체에서 권장 하는 최소 수입니다. 제조업체의 지침에 따라 프로브 솔루션, 재구성 후 우리가 만든 1시 10분 희석 재고 솔루션의 희석된 솔루션-20 ˚C에서 5 µ L aliquots에 저장. 각 약 수 한 번만 사용 되었다. 최적화, 하나 직렬 해야 희석 1:10에서 희석 솔루션 및 테스트 어느 농도 수익률 최상의 신호 대 잡음 비율. 1: 250, 1: 500, 1:1000, 및 원래 주식에서 1: 2000의 희석 시리즈를 만드는 것이 좋습니다. 우리의 경우, 1: 500 희석 요인 CF 590 및 Q 670 프로브 세트에 대 한 최상의 신호 대 잡음 비율 귀착되는.
최적의 고정 시간 성공적인 smFISH 신진 효 모에 대 한 중요 한 이기도합니다. 우리는 하룻밤 고정 4 ˚C에서 발견 보다는 크게 meiotic 샘플에 대 한 smFISH 결과의 품질과 일관성을 개선 20 분 동안 실내 온도에 고정. 우리는 테스트 하지 않지만 고정 식물 샘플 영향을 줄 수 어떻게 하룻밤, 실 온에서 고정이 성장 조건을 잘 일했다. 따라서, 새로운 긴장 또는 성장 조건에 대 한 smFISH 프로토콜을 최적화 하려면 좋습니다 실내 온도에 짧은 고정 시간으로 시작 하 고 증가 하는 고정 시간 신호의 높은 다양성 발생 하는 경우.
다른 게시 프로토콜3,,2223와 비교해, 우리의 프로토콜 소화와 교 잡 동안 VRC의 높은 농도 중 VRC RNase 억제제를 사용 합니다. 이 두 단계에의 VRC 추가 향상 smFISH 결과의 일관성 가능성이 더 나은 nuclease 활동, zymolyase 믹스 (효소 원유 추출 물에서 정화와 RNase 포함 될 수 있습니다에 의해 도입 될 수 있습니다에 대 한 RNA 분자를 보존 오염 물질)입니다. 따라서, 우리의 프로토콜 또는 VRC의 최적화를 위한 더 높은 농도에 나와 VRC의 금액을 사용 하는 것이 좋습니다.
셀의 상당 부분 버퍼 B에 formamide 워시 버퍼 세척 단계 동안 손실 될 수 있습니다. 셀 손실을 줄이기 위해, 하나는 원심 분리 속도 증가할 수 있었다. 우리의 경우, 버퍼 B 동안 우리의 샘플 작은를 고속 (21000 x g)를 사용 하 여 씻어 크게 감소 셀 손실. 그러나, 셀 될 zymolyase 소화 후 매우 깨지기 쉬운 그래서 원심 분리 속도 변경 권장 되지 않습니다. 대신, 셀 formamide 워시 버퍼에서 세척 하는 동안 작은 도움이 크게 미국 과학에서 낮은 접착 튜브 사용 하 여 하는 것이 좋습니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜 지속적으로 효율적인 이미징 충분히 밀도 세포의 단층을 생성할 수 있습니다. 일반적으로, 7 시야를 산출 해야 한다 > 130 셀 정량화에 적합.
마지막으로, 그것은 대 한 최적의 이미지 분석에서 필요한 출력을 결정 하는 것이 중요입니다. SmFISH 관광 명소를 검색, 게시 된 분석 프로그램 일반적으로 배경 신호를 제거 하려면 가우스 알갱이 사용 하 여 원시 이미지를 필터링 하 고 이미지2,17의 각 집합에 대해 사용 하 여 신호 대 잡음 비율을 결정 하기 위해 사용자에 게 요청. 불행히도, 거기 현재는 적절 한 매개 변수 결정 됩니다, 단일 표준 이며 그래서 이러한 다른 설정의 몇 가지 경험적 테스트 하는 것은 필요. 각이 단계에 필요한 매개 변수를 설정 하려면 하나는 반복적으로 다른 매개 변수 집합을 입력 하 고 얼마나 잘 각 세트에서 얻은 결과 일치 하는지 몇 가지 대표적인 셀에서 수동 계산에서 확인 해야 합니다. 매개 변수 한 집합이 발견 되 면 그것은 다른 성장 조건과 유전적 배경에 불구 하 고 얻은 이미지의 대부분을 위해 사용할 수 있습니다.
또한, 하나는 smFISH 이미지의 최대 강도 투영 정량화22전에 수행할 수 있는 경우 테스트할 수 있습니다. 이 단계 자리 탐지 알고리즘을 단순화 하 고 크게 영상 시간, 비록 그들의 subcellular 지 방화 등 개별 관광 명소에 대 한 일부 잠재적으로 유용한 정보 비용 감소. 우리의 경우, NDC80 유전자에 의해 생산 하는 mRNA 분자의 수가 이었다 충분히 낮은 반점 (드문 일 신진 성적 증명서3,7효 모에 대 한)이이 처리 후 잘 분리 되었다. Colocalization 분석 중요 한 경우에 분석 파이프라인 각 smFISH 자리 colocalization를 평가 하기 위해 각 채널에서의 위치를 결정 해야 합니다. 특정 질문에 따라 질문 하 고, 각 명소의 강도 등 다른 정보 또한 추가 분석을 위해 파이프라인에서 압축을 풀 게 할 수 있습니다. 프로토콜에 단계는 키를 최적화와 이미지 분석 파이프라인 관심 질문 공부를 smFISH 데이터의 높은 품질을 얻기에서 결정적 이다.

유전자 발현의 동적 규칙 물질 대사에 유기 체, 환경 스트레스, 감염, 그리고 변화에 응답의 개발 드라이브. RNA 풍부를 측정 하는 기술에 의존 하는 transcriptional 규칙에 집중 하는 연구. 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH), 불리 한 그러한 방법, 단일 셀1,2개별 RNA 분자의 탐지를 위해 사용 됩니다. 이 메서드는 셀 유전자 발현의 측정 및 세포내 RNA 지역화의 결정을 수 있습니다.
가장 일반적으로 사용된 smFISH 기술, 개별 RNA 분자의 탐지 여러 짧은 DNA 프로브를 (종종 ~ 48 20-메 르 프로브) 대상 RNA 보완 하 고 같은 형광 염료를 활용 합니다. 약한 신호 귀착되는 단일 형광 프로브의 바인딩 하지만 모든 프로브의 앙상블에서 신호는 강력한. 이 기능은 크게 단일 프로브 오프 대상 바인딩 전시 수 있습니다, 비록 이러한 신호는 될 것으로 예상 매우 약한 대상 RNA 분자3의 비교 때문에 신호 대 잡음 비율을 향상 시킵니다. 오류 검출, 내 RNA 분자의 수는 계산 고 다양 한 성장 조건 및 다른 뮤턴트 들을 비교 될 수 있습니다.
첫 번째 개발, 이후 smFISH 맞게 조정 되었습니다 유전자 식4, 녹음 방송 신장1,2,5,6,7 을 파열 transcriptional 접합 등의 다양 한 측면을 연구 하 , 8 , 9, 세포내 유전자 식10,11,12, 그리고 RNA 지역화13,,1415. 최근에, 우리는이 방법을 사용 하는 동일한 유전자의 두 사본 isoforms의 표정을 연구 하 짧은 사본 isoform (NDC80ORF) 긴 isoform (NDC80luti 와 공유의 전체 순서는 )16. 두 개의 mRNA isoforms를 고유 하 게 식별 하려면 사용 하는 두 개의 프로브 세트: 1 세트 NDC80luti의 독특한 시퀀스에 특정 이며 다른 설정, 다른 형광 성 염료에 활용 된 두 개의 isoforms의 공통 영역에 바인딩합니다. NDC80luti RNA로 식별 됩니다 colocalized 자리 두 형광 신호, 반면에 NDC80ORF RNA만 일반적인 프로브 세트에서 신호를 포함 하는. 수 이후는 NDC80ORF 성적 조사 교 잡의 높은 효율성과 높은 신호 대 잡음 비율은 자신 있게 smFISH 관광 명소를 식별 하 고 오류를 감소 하는 데 필요한 "빼기" 방법에 의해 계산 번 식입니다.
이 문서는 싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 smFISH를 수행 하기 위한 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜, 휴대폰 번호, 고정 시간, 소화, 소화 버퍼, 프로브 농도, 시간과 교 잡에서 버퍼 smFISH 실험을 위해 사용 했다 SK1 긴장의 배경 S. cerevisiae 겪고 식물에 대 한 최적화 된 성장 또는 감수 분열입니다. 그러나, 우리는 또한이 원고에 참고: (1) 이미지 수집, 및 (2) 다른 스트레인 배경 및 성장 조건에 대 한 추가적인 최적화 필요할 수 있는 프로토콜의 단계 후 smFISH 데이터의 품질을 확인 하는 메서드.

<table><tbody><tr><td>BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Store at 4 &amp;deg;C for short-term. Vortex before use.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Store at -20 &amp;deg;C after reconstitution in water. Protect from light.</td></tr><tr><td>50% Dextran Sulfate</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Ethanol (100%, 200 proof)</td><td>various</td><td></td><td>Flammable.</td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>various</td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C after dissolving in nuclease-free water.</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Probe library, diluted in TE, pH 8.0&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots (5 &amp;micro;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots.</td></tr><tr><td>200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Low-adhesion tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Store at room temperature.</td></tr></tbody></table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 단일 셀 검색 하 고 개별 RNA 분자를 계산 하는 능력 때문에 유전자 발현을 연구 하는 강력한 기술입니다. 깊은 시퀀싱 기반 방법 보완, smFISH 사본에 셀 변화와 특정된 RNA의 subcellular 지 방화에 대 한 정보를 제공합니다. 최근, 우리 사용 smFISH 신진 효 모 감수 분열 동안 NDC80 유전자의 표현 연구, 어느 두 기록에서 isoforms 존재 하 고 짧은 사본 isoform는 긴 isoform와 공유의 전체 시퀀스. 각 사본 isoform를 자신 있게 식별 하려면 우리는 알려진된 smFISH 프로토콜을 최적화 하 고 높은 일관성과 신진 동안 샘플에 대 한 smFISH 데이터의 품질을 얻은 감수 분열 효 모. 여기, 우리는이 최적화 된 프로토콜, 우리 smFISH 데이터의 고품질 얻을 여부 및 다른 효 모 종자와 성장 조건에서이 프로토콜을 구현 하기 위한 몇 가지 팁을 확인 하는 데 사용할 조건을 설명 합니다.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.2K 조회수.  University of California, Berkeley. 이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

라이브 고정화 효모 세포의 시각화에 대한 신속한 기술

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

연구

생물학

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

발생학

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...