Name: 2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
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우리는 친절 하 게 그의 참여 프로젝트, 생산적인 토론과 좋은 감독에 대 한 교수 박사 로타어 Willmitzer를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 proteomic MS 측정 도움 박사 다니엘 Veyel에 감사입니다. 우리 부인 Änne Michaelis LC MS 측정 우리 귀중 한 기술적인 도움을 제공 주셔서 감사 합니다. 또한, 우리는 닥터 모니카 Kosmacz와 박사 Ewelina Sokołowska Weronika Jasińska를 그들의 도움과 원래 원고에서 작업에 참여에 대 한 기술 지원을 감사 하 고 싶습니다.

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	<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+as+global+regulators:+A+new+view+of+protein+regulation.">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li><li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch.">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=METLIN:+A+metabolite+mass+spectral+database.">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li><li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity.">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li></ol>

저자는 공개 없다.

제시 프로토콜 대상 단백질의 PP와 오후 단지의 병렬 식별 수 있습니다. 최종 결과를 복제에서 실험 8-12 주 만큼 적게 완료할 수 있습니다. 완전 한 AP 걸립니다 약 4-6 h 12 ~ 24 샘플 집합에 대 한 우리의 프로토콜 중간 처리량 분석을 위한 적합 한 렌더링.
프로토콜, 되 고 전반적으로 간단에 불구 하 고 중요 한 단계의 수가 있다. (i) 충분 한 양의 입력된 단백질 및 선호도 구슬 대사 산물 탐지의 동적 범위를 도달 하는 중요 한 이다. 효율적인 셀 세포 따라서 절차에서 중요 한 단계입니다. 불 쌍 한 단백질 수율 차선 세포의 용 해 버퍼/재료 비율 또는 자료의 부족 분쇄의 결과 될 수 있습니다. (ii) 해야 주의 사용된 시 약 MS-친화입니다. 강한 세제, 글리세롤, 또는 소금의 과도 한 양의 그들은 MS 검색을 방해 피해 야 한다. (iii) Agarose 구슬 해서는 안됩니다-건조 단계, 세척 하는 동안 그리고 진공 매니폴드를 사용 하는 경우 그것은 구슬 파괴 또는 복잡 한 안정성에 영향을 미칠에 그렇게 하지 않도록 느린 흐름 속도 적용 하는 것이 중요.
제시 프로토콜에 중요 한 몇 가지 가능한 수정이 있다: (i) 제정 CaMV35S 모터를 사용 하 여 미끼 단백질의 양을 최대화 하는 우리. Overexpression, 매우 유용한, 고 수 있습니다 세포 항상성28 에 심각한 영향을 미칠 생리 적으로 관련이 없는 상호 작용의 형성으로 이어질. 식 사용 하 여 네이티브 발기인 기능 손실 배경에서 가능한 진정한 생물학 인터 검색에 대 한 우수한 여겨진다 태그 단백질입니다. 일반적으로 식물 세포 배양에 표현 하는 단백질에 대 한 식물 배경 관련 인터를 식별 하는 데 필요한 증명할 수 있습니다. (ii) 작업할 때 막 단백질, 세포의 용 해 버퍼는 MS 호환 세제로 보완 될 필요가 있다. (iii) 두 번째 친 화력 정화 단계 소개 가양성 true 반응 비율을 개선 하 고 EV 컨트롤29필요 수 있습니다. 두 개의 독립적인 효소 분열 사이트 소설 탠덤 태그 모두 힘들고 시간이 소모 되는 마에 다 외. 201411, 추가 크기 배제 크로마토그래피 단계에 매력적인 대안을 선물 한다.
AP의 가장 심각한 결점은 잘못 된 반응의 높은 속도. 이유는 수많은. 제정 overexpression 이미 언급 했다. 순수 없는 상호 작용의 다른 소스 고립 된 세포를 사용 하지 않는 한 단백질과 다른 subcellular 구획에서 대사 산물의 혼합물을 포함 하는 전체 세포 lysates의 준비 이다. Subcellular 지 방화는 진정한 인터에 대 한 필터링을 사용 해야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 잘못 된 반응의 대부분 난다 바인딩 단백질과 agarose 수 지 사이에서 유래한 다. 그러나 두 번째 정화 단계의 소개, 위에서 설명한 문제에 최고의 솔루션을 제공 합니다, 그리고 시간과 처리량 비용 온다. 또한, 약한 상호 작용 프로토콜 확장으로 손실 될 수 있습니다. AP의 또 다른 경고는 포괄적인 정보 제공 하는 위하여 대상 단백질의,에 불구 하 고 baited 단백질의 직접 및 간접 목표 구별 불가능 이다. 타겟된 분자 접근 상호 작용을 확인 필요 합니다.
MS 기반 대사체학 함께 AP S. cerevisiae12. 단백질 복합물 공부 하는 사용 했다 이 작품은, 마찬가지로 지질, 극 지와 반 극 지 화합물 유지 세포 lysates에서 고립 된 단백질 복합물에 바인딩된 우리의 이전 관찰13 함께 제시 프로토콜에 대 한 개념적 기초를 제공 합니다. 우리의 프로토콜 3 독특한 포인트 특징 이다: (i) 반면에 누 룩을 작동12, AP 검색 뿐만 아니라 소수 하지만 또한 친수성 단백질 ligands에 적합 하다는 설명. (2) 3-에서-하나의 추출 프로토콜을 도입 하 여 미끼 단백질의 단백질 및 대사 산물 인터를 공부 하는 단일 AP은 사용할 수 있습니다. (iii) 우리는 식물 세포 프로토콜을 적응.
향후 두 개의 독립적인 효소 분열 사이트 소설 탠덤 태그를 만드는 방법에 집중할 것 이다. 우리 또한 낮은 풍부한 식물 호르몬과 같은 작은 분자에 프로토콜의 적합성을 탐험 하 고 싶습니다.

방법을 설명 여기 근처-vivo에서 세포 lysate 조건에서 선택의 단백질의 대사 산물과 단백질 파트너의 식별에 목표. 그것은 많은 더 많은 대사 산물 오늘 특징 보다는 중요 한 규제 기능1는 추측 하고있다. 대사 산물은 생물학 스위치, 활동, 기능, 및 그들의 수용 체 단백질의2,,34의 지역화 변경으로 작동할 수 있다. 지난 10 년간에서 근처-vivo 조건, 또는 vivo에서 PMI의 식별 사용 여러 가지 획기적인 방법이 개발된5되었습니다. 사용할 수 있는 접근은 두 그룹으로 분리 수 있습니다. 첫 번째 그룹에는 소설 단백질 파트너를 트랩 하려면 알려진 대사 산물 미끼와 함께 시작 하는 기술 구성 되어 있습니다. 방법은 선호도 크로마토그래피6, 마약 선호도 응답 대상-안정성 분석 결과7, 항 암 치료-proteomics8및9프로 파일링 열 프로테옴 포함 됩니다. 알려진된 단백질 작은 분자 ligands10,11을 식별 하기 위해 시작 하는 단일 메서드 두 번째 그룹에 의하여 이루어져 있다.
MS 기반 lipidomics 함께 AP Saccharomyces cerevisiae12. 단백질 지질 단지 분석 하는 데 사용 했다 시작 지점으로 저자 표현 21 효소 ergosterol 생 합성에 관여 하는 효 모 종자를 사용 하 고 103 kinases 융합 협동 친 화력 정화 (꼭지) 태그. 효소의 70% 및 20%는 kinases의 복잡 한 단백질 지질 상호 작용 네트워크로 빛을 발산 하는 다른 소수 성 ligands를 바인딩할 발견 됐다.
이전에, 마찬가지로 지질, 극 지와 반 극 지 화합물 또한 유지 세포 lysates13에서 고립 된 단백질 복합물에 바인딩된 수 설명 합니다. 이러한 결과에 따라, 우리는 AP를 최적화 하기로 메서드 출판 이전 식물 세포 및 친수성 화합물1410,11 . 이 목적으로, 밴 Leene 외. 2010, PPI 연구15공장에서 성공적으로 사용 하 여 설명 탭 벡터 사용 했습니다. 유전자 변형 라인을 얻는 데 필요한 시간을 단축, 우리 애기 세포 배양에 결정 했다. 우리 고용 원스텝 메 틸 tert-부 틸 에테르, (티비) / 메탄올/물 추출 방법, 단일에서 단백질 (펠 릿), 지질 (유기 단계), 그리고 친수성 대사 (수성 단계)16 의 특성을 허용 친 화력 정화 실험입니다. EV 컨트롤 라인 가양성, 혼자 태그에 바인딩 단백질 예 제외에 도입 되었다. 우리는 3 (5) 태그 개념의 증거로 서 nucleoside diphosphate kinases 애기 게놈 (NDPK1-NDPK3)에 존재. NDPK1 티 S상호 작용 설명 수 다른 결과, 중-전이 효소와 티. 따라서 우리는 NDPK1 glutathionylation14받게 됩니다 증명할 수 있습니다.
정리해 보면, 제시 프로토콜 단백질-단백질 및 단백질 작은 분자 상호 작용 네트워크 특성화를 위한 중요 한 도구 이며 기존 방법에 비해 주요 사전 구성.

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthylacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 protease inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Protease</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&amp;nbsp;Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>Methanol&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid&amp;nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 Platform Shaker</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh (Wire diameter 34 &amp;micro;M, thickness 55 &amp;micro;M, open area 14%)</td><td>Prosepa</td><td>Custom order</td><td></td></tr><tr><td>Glass Funnel, 47 mm, 300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>Filter Bottle Top 500 mL 0,2 &amp;micro;M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Mill MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol &quot;&quot;Classic&quot;&quot; with 2 different screw caps without filters</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>Filter (small) 35 &amp;micro;M pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 &amp;amp; M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>Variable Speed Tube Rotator SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>Rotary dishes for rotators SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td><td>Restek&amp;nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td><td>Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler&amp;nbsp;Vials</td><td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&amp;ouml;r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Column</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC system&amp;nbsp;</td><td>Waters&amp;nbsp;</td><td>Custom order</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 &amp;micro;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td><td>Waters&amp;nbsp;</td><td>186003533</td><td></td></tr><tr><td>High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Expressionist</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes

세포질 과정은 단백질, 대사, 핵 산 등과 같은 생체 분자 간의 상호 작용에 의해 통제 된다. 단백질 단백질 상호 작용 (PPI)의 조사는 없는 참신, 실험적인 접근 생 단백질 대사 산물 상호 작용 (PMI)을 특성화 목표로 오히려 최근 개발을 구성 합니다. 여기, 우리는 PPI와 미끼 라고 선택의 단백질의 PMI의 동시 분석을 허용 하는 프로토콜을 제시. 우리의 프로토콜은 최적화 된 애기 셀 문화 및 친 화력 정화 (AP)를 결합 한 질량 분석 (MS)와 함께-기반 단백질 및 대사 산물 검출. 즉, 미끼 단백질 선호도 태그 융합을 표현 하는 유전자 변형 애기 라인 기본 세포 추출을 lysed 처음은. 방지 태그 항 체는 풀 미끼 단백질의 단백질 및 대사 산물 파트너 다운 하는 데 사용 됩니다. 친 화력 정화 단지 1 단계 메 틸 tert를 사용 하 여 추출 됩니다-부 틸 에테르 (티비) / 메탄올/물 방법. 대사는 극 지 또는 소수 성 위상, 분리 하는 동안 단백질 펠 릿에서 찾을 수 있습니다. 대사 산물과 단백질 다음 울트라 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (UPLC MS 또는 UPLC-MS/MS)에 의해 분석 된다. 빈 벡터 (EV) 제어 라인 가양성을 제외 하는 데 사용 됩니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점은 근처 생리 적 조건 (세포 lysate)에서 동시에 대상 단백질의 단백질 및 대사 산물 파트너의 식별 수 있습니다. 제시 방법 간단, 신속, 그리고 식물 세포 배양 이외의 생물 학적 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다.

원래 연구에 3 개의 A. thaliana NDPK 유전자 PSB L 셀 서 스 펜 션 문화 제정 35S 발기인14 (그림 1)의 통제에 overexpressed 했다. 탠덤 선호도 태그 미끼 단백질의 카 또는 아미노-터미널 끝을 융합 했다. 친 화력 정화 단지 티비/메탄올/물 추출16를 받게 했다. 선호도 뽑아 단백질과 작은 분자는 MS (테이블 S2 및 S3)를 사용 하 여 확인 되었다.
판정에 대 한 수정, 빈 샘플 작은 분자 오염 물질 화학 제품 및 실험실 소모품에서 제외 사용 되었다. 또한, 대사 산물 선호도 태그 중 하나에 바인딩 또는 혼자 수 지 단백질은 고려 EV 컨트롤 라인을 사용 하 여. 참 긍정 양측 쌍이 아닌 학생의 t-검정, Benjamini & Hochberg 틀린 발견 비율을 검색 하 보정 대사 (테이블 S4) 및 단백질 (테이블 S5) 크게 NDPKs AP에 농축 식별에 적용 된 EV 컨트롤 라인에 비해 (N-와 C-말기 태그 NDPKs) 실험 (루즈벨트 < 0.1). Note는 이전 작품에서 우리 사용 부재/존재 조건을 단백질과 작은 분자 인터 윤곽을 그리 다.
대표 결과 NDPK1를 위한 dipeptides, 우리의 그룹에 작은 분자 레 귤 레이 터의 새로운 클래스에 대사 산물 데이터 초점 동안 받는다. Proteomic 분석 NDPK1의 26 상 상속 단백질 파트너를 공개 했다. 공동 NDPK1으로 같은 subcellular 구획에서 화 된 단백질에 대 한 추가 필터링 (cytosol) 목록 13 상 상속 단백질 인터 한정. 확인 된 단백질 가운데 티 S-전이 효소, 두 개의 신장 개시 요인, tubulin, 및 aconitate hydratase. Metabolomic 분석 4 dipeptides 발 레이, Ile Glu, 레이-한 일-NDPK1와는 특별히 공동 eluted Phe 밝혀 (그림 2). 참고 모든 4 개의 dipeptides 그들의 N-말단, 공유 바인딩 특이성 제안에 소수 성 잔류물을 공유 합니다.
알려진된 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지 우리가 찾을 쿼리 13 단백질과 스티치 데이터베이스25 (그림 3)에 대 한 4 개의 dipeptides 식별. 여러 가지 관측을 만들 수 있다: (i) 이전 NDPK1에 대 한 보고는 없는 인터. (ii) APX1 ortholog 알데하이드 효소 가족 ALDH7B4, 번역 개시 인자 FBR12 다른 번역 개시 인자 유전자 AT2G40290에 의해 동안에 상호 작용을 보고 되었다. (iii) 확인 된 dipeptides 더 단백질 파트너를 보고 있다. 공동 eluted dipeptides 이전 모든 검색 된 식물 단백질에 관련 된 보도 했다. 그러나, 그들은 다른 유기 체에서 중요 한 역할 놀이: 레이-일, 예를 들면, 인간 세포 선26neurotrophin 활성화 효과가 있다. 참고 실험 시스템의 정확한 토폴로지 확인 허용 하지 않습니다. 예를 들어 한 dipeptide NDPK1와 직접 상호 작용할 수 있지만 잘 공동 순화 된 단백질의 어떤 관련이 있을 수 있습니다.
함께 찍은, 우리의 결과 보여준다 질량 분석, 함께 AP를 고용 설립된 절차, 단백질-단백질 및 단백질 작은 분자 인터의 식별을 용이 하 게 하 고 도움에 대 한 광범위 한 정보를 생성 합니다 위하여 대상 단백질의.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> 그림 1입니다. AP-MS 워크플로의 체계입니다. (A) 식물 세포 배양에서 네이티브 녹는 분수의 준비. (B) AP 절차의 다음 단계. 열에 샘플을 로드 한 후 관심 (POI) 탭 태그 융합 단백질 agarose 구슬에 움직일 IgG 항 체에 바인딩합니다. 열 세척 언바운드 단백질 및 대사 산물의 제거를 촉진 한다. AcTEV 분열을 수행한 후 포 단백질 대사 산물 단지는 eluted. (C) 단백질 및 대사 산물 분수 반 양적 MS 분석 뒤에 단지의 분리. 이 그림의 일부는 Luzarowski 외. 201714에서 재현 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> 그림 2입니다. 특히 공동 NDPK1와 방출 dipeptides. 4 dipeptides 발 레이 (A), Ile Glu (B), 레이 일 (C), 및 일 페 (D) AP 실험에서 측정의 평균 농도 구성 했다. 모든 4 개의 dipeptides NDPK1 샘플 EV 제어에 비해 상당한 농축 표시 (별표 나타냅니다 루즈벨트 < 0.1). 오차 막대 대표 6 측정 표준 오차 (N-3 복제와 C 말기의 3 태그 단백질). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> 그림 3입니다. 공동으로 NDPK1, 방출 하는 모든 분자의 상호 작용 네트워크 이전만 고려 하는 스티치 데이터베이스에 대해 쿼리 실험 및 데이터베이스 증거 (신뢰 > 0.2). 높은 신뢰 상호 작용의 더 높은 기회를 나타냅니다 하 고 예금 된 데이터에 따라 계산 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블 S1입니다. MaxQuant 출력 테이블 "parameters.txt". 테이블 식별 및 정량화, 뿐만 아니라 사용 하는 데이터베이스에 대 한 정보에 대 한 임계값이 포함 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블의 S2 MaxQuant에서 정보 출력 테이블 "proteinGroups.txt". 테이블에는 모든 확인 된 단백질 그룹, 농도, 및 고유 펩 티 드 및 점수 번호 등 추가 정보 목록이 포함 되어 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블의 S3 극 지 대사 산물의 분석을 포함 하는 출력 파일입니다. 테이블에 모든 확인 된 대량 기능 특정 m/z, RT 및 강도 특징의 목록이 포함 되어 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블 S4입니다. Dipeptides는 NDPK1, NDPK2 또는 NDPK3 미끼로 사용 되었다 AP 샘플에서 발견. Dipeptides 빈 샘플에는 목록에서 제외 했다. 두 개의 독립적인 라인 (태그에 어느 N-또는 C-말단) 각 NDPK는 3 중에서 실행 했다. 학생의 t-테스트 및 p의 수정 추가-Benjamini를 사용 하 여 값 및 Hochberg 메서드 NDPKs의 크게 농축된 끌어와서 파트너를 결정 하는 데 사용 되었다 (루즈벨트 < 0.1). 주어진 ΔRT 계산 됩니다 참조 화합물과 monoisotopic 질량 주어진 Metlin27에 관하여 Δppm. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블 S5입니다. NDPK1와 공동 순화 하는 단백질. 3 중에서 2 개의 독립적인 라인 (태그에 어느 N-또는 C-말단) 각 NDPK 실행 했다. 학생의 t-테스트 및 p의 수정 추가-Benjamini를 사용 하 여 값 및 Hochberg 메서드 NDPKs의 크게 농축된 끌어와서 파트너를 결정 하는 데 사용 되었다 (루즈벨트 < 0.1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

2-1-one-step-affinity-purification-for-parallel-analysis-protein

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K 조회수.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. 단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

비디오: 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is also a key component in the development of new therapeutics. The evolving era of functional proteomics is fueling the demand for high-throughput protein purification and improved techniques to facilitate this. It was hypothesized that a multi column plate adaptor (MCPA) can interface multiple chromatography columns of different resins with multi-well plates for parallel purification. This method offers an economical and versatile method of protein purification that can be used under gravity or vacuum, rivaling the speed of an automated system. The MCPA can be used to recover milligram yields of protein by an affordable and time efficient method for subsequent characterization and analysis. The MCPA has been used for high-throughput affinity purification of SH3 domains. Ion exchange has also been demonstrated via the MCPA to purify protein post Ni-NTA affinity chromatography, indicating how this system can be adapted to other purification types. Due to its setup with multiple columns, individual customization of parameters can be made in the same purification, unachievable by the current plate-based methods.

A multi-column plate adapter allows chromatography columns to be interfaced with multi-well collection plates for parallel affinity or ion exchange purification providing an economical high throughput protein purification method. It can be used under gravity or vacuum yielding milligram quantities of protein via affordable instrumentation.

다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하는 경제적이고 다재다능한 고처리량 단백질 정화 시스템

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

<meta charset="utf8"></head><body>His-tagged FEN1 단백질의 효율적인 정제를 위한 FPLC 최적화

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Optimizing Affinity Chromatography for His-Tagged FEN1 Protein

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

생물학

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

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2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

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