독립적인 연구, 기술 및 생산, 덴마크어 위원회 #4005-00029 부여

실험적인 체제 윤리적 및 법적 제한이 있으며 로스킬레 대학 계약 실시 했다. 실험 설정에 대 한 개요는 그림 1 과 그림 2에 광학 카메라의 메커니즘에서 볼 수 있습니다.
1입니다. 준비
<ol><li>벤치 및 실험의 시작 이전에 70% 에탄올과 모든 장비를 청소 하 여 살 균 층 류 벤치에서 모든 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>셀에 대 한 최적의 조건을 보장 하기 위해 5% CO2 와 37 ° C에서 기존의 인큐베이터에 광학 카메라를 배치 합니다.</li>
	<li>10 %FBS T75 플라스 크에서 1 x 항생제 (페니실린과 스) DMEM 미디어에서 HaCaT 세포 성장.</li>
	<li>1 mL 1 x 트립 신을 사용 하 여 셀을 분리 하 고 하위 그들 매 3-4 일 함으로써 배양 세포 층에 분산. 사용 하기 전에 실내 온도에 열 중.</li>
</ol>2. 48-웰 스 결정 플레이트에 셀 생성 HaCaT의 단층
<ol><li>파스퇴르 피 펫과 T75 플라스 크에서 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>T75 플라스 크에 5 mL 1 x 살 균 PBS를 추가 하 여 플라스 크에 부착 세포를 씻어. 참고: PBS 칼슘과 마그네슘의 무료 인지 확인 합니다.</li>
	<li>PBS를 순환 하 고 파스퇴르 피 펫과 그것을 제거 합니다.</li>
	<li>2.2-2.3 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>플라스 크를 1 mL 1 x 트립 신을 추가 하 고 셀 계층에 걸쳐 분산.</li>
	<li>세포 분리 될 때까지 기존의 인큐베이터에서 37 ° C에서 플라스 크를 품 어 (5-8 분은 대부분 셀 라인에 대 한 충분 한).</li>
	<li>보기는 현미경에서 세포를 분리 하는 경우 일단 셀을 분리 하는 추가 10% 일반 문화 미디어의 9 mL 1 x 트립 신을 비활성화 하는 FBS.</li>
	<li>어느 hemocytometer와 셀 계산 coulter 카운터 또는 유사한. 참고: Trypan 블루 볼 죽은 세포를 사용할 수 있습니다. 그러나,에서 1 x trypsin HaCaT 세포는 완벽 하 게 라운드 때 살아.</li>
	<li>48-잘 조직 문화 라운드 바닥 플레이트 (표준 접시)에 250 µ L 10 %FBS 미디어에서 104 셀/잘 x 7.5를 전송 합니다. 참고: 분석 결과 또한 설정할 수 있습니다 6, 12, 24, 나는 모든 광학 현미경 분석 수 96 잘 접시에.</li>
	<li>부드럽게 접시 측면에서 세포는 동등 하 게 우물, 확산 되도록 좌우로 움직이거나 셀 우물의 센터에 모여 것입니다. 셀은 균등 하 게 언론에 확산 되도록 가벼운 현미경 검사</li>
	<li>하룻밤 또는 우물의 바닥에 셀은 준수 때까지 37 ° C에서 기존의 CO2 인큐베이터에 접시를 넣어.</li>
</ol>3입니다. 마이그레이션 효과 대 한 자극의 추가
<ol><li>우물은 90-95%는 가벼운 현미경 합칠 경우 확인 하십시오.</li>
	<li>미토마이신 C는 매체의 적절 한 금액에서의 10 µ g/mL를 준비 합니다. 참고: 이 연구에서는 미토마이신 C는 1 mg/mL에서 재고 솔루션에 4 ° C에서 유지 됩니다. 미토마이신 C 솔루션에서 2-8 ° c.에 어둠 속에서 1 주일에 저장 될 수 있다</li>
	<li>각 우물에서 파스퇴르 피 펫을 보낸된 미디어를 제거 합니다.</li>
	<li>각 우물에 미토마이신 C의 5 µ g/mL의 250 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>2 h 37 ° C, 5% CO2접시를 품 어.</li>
	<li>그들은 매체의 적절 한 금액에서을 diluting 하 여 펩 티 드의 자극을 준비 합니다. 참고: 이 연구에서는 인간과 소 Lactoferrin와 Lactoferricin 250 µ L의 볼륨에서 25 µ g/mL에서 테스트 되었습니다.</li>
	<li>미토마이신 C 파스퇴르 피 펫과 함께 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>1 x 1 x PBS (실내 온도) 및 제거는 파스퇴르와 세척의 250 µ L 플라스틱 웰 스 워시.</li>
	<li>1 x PBS의 250 µ L을 추가 하 고 수동으로 200 µ L 피 펫 팁과 수직 우물 스크래치. 각 잘 새로운 피 펫 팁을 사용 합니다.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 250 µ L 펩 티 드 자극을 추가.</li>
	<li>접시의 양쪽에 나사를 조정 하 여 광학 카메라 시스템에 접시를 탑재 합니다. 결정에 뚜껑을 두고. 참고: 카메라 뚜껑을 열고 필요한 경우 작동할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 프로그램을 컴퓨터에 광학 카메라에 대 한 설정
<ol><li>왼쪽에 작업 표시줄에서 취득 을 클릭 합니다.</li>
	<li>왼쪽에 작업 표시줄에서 상처 치유 기능을 선택 합니다.</li>
	<li>플레이트 타입 플레이트 그림아래를 클릭 하 여 선택 합니다.</li>
	<li>그들을 표시 하 여 웰 스, 사용, 선택을 취소 하 고 화면에 왼쪽 상단에 사용 을 클릭 합니다. 참고: 모든 우물은 기본적으로 선택 됩니다.</li>
	<li>우물 우물 중 하나에 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 셀의 위치에 맞게에 렌즈의 초점을 조정 합니다. 참고: 자동 초점 또한 접시 그림의 오른쪽에 막대를 이동 하 여 수동으로 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>사진 간격 에서 이미지에 대 한 기간을 설정 (예: (00: 30:00)).</li>
	<li>원하는 기간 (예: 97 반복)에 맞게 반복의 수를 설정 합니다.</li>
	<li>오른쪽 아래 모서리에 있는 시작 버튼을 클릭 하 여 실행을 시작 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. 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저자는 공개 없다.

개발, 상처 치유, 면역학, 및 암 연구에 이동의 중요성 여러 다른 방법 마이그레이션 연구를 주도하 고 있다. 마이그레이션 확장의 표현 또는 셀에 의해 간격의 폐쇄 수 있습니다. 그것은 쉽게 하는 단층 세포 성장 이며 성장 하는 특정 폼8셀 보다 스크래치 스크래치의 가장 자주 폐쇄 테스트 됩니다. 우리의 연구는 기술 마스터 하기 쉽고 저렴 한 비용으로 수동 긁힘에 대 한 최적?...

마이그레이션 여러 생리 적 측면을 영향을 미치는 중요 한 과정 이다. 상처 치유, 마이그레이션 용이 피부 다시 epithelization. 치유 되지 않은 상처, 만성 상처 등에서 기회 주의 박테리아 상처의 감염 원인과 오픈 상처 박테리아 성장과 biofilm1,2의 형성에 이상적입니다. Biofilm 내성 박테리아의 개발의 원인 중 하나는 우리의 현대 사회3에 가장 큰 위협 중 하나입니다. 상처 치유, 면역 세포는 biofilm을 침투 수 없습니다. 암, 암 세포의 전이의 중추적인 단계는 단단한 종양4,5환자에 대 한 죽음의 주요 원인입니다. 따라서, 그것은 마이그레이션 공부 수 중요 합니다.
스크래치 분석 결과 종종 저렴 하 고 쉽게 부착 셀 라인, 섬유 아 세포, 내 피, 상피 세포 라인6,7등에서 수행 하는 때문에 셀 마이그레이션 테스트 하는 데 사용 됩니다. 오늘, 흠집8, 수행 하기 위한 여러 가지 방법이 존재 하 고 다른 물자 보고 되었습니다 사용 되, 이쑤시개9, 셀 기구10, 레이저11및 전기 전류12를 포함 하 여. 모든 방법은 장단점이 서로 다른, 그리고 방법을 따라 셀 유형, 예산 및 분석 도구에 따라 결정 되어야 한다. 예를 들어, 사용한 셀 유형 코팅, 수동 압력 제거 해야 하는 경우 예: 이 쑤 시 게 또는 피 펫 팁, 영역 내에서 마이그레이션 영향, 다른 메서드를 사용 해야 합니다. 이 연구에서 우리는 수동 근 근이 살아가고에 집중할 것 이다.
수동 스크에 대 한 단점은 크기의 변형, 긁힘, 모양 및 스크래치의 가장자리에서 셀의 축적. 많은 프로토콜 존재 하는, 그리고 높게 인용 된 종이 조언 증가 속도 및/또는 긁 적13후 철저 한 세척. 또한, 여러 가지 방법은 세포의 확산 마이그레이션 구별 수 없습니다 있기 때문에 따라서 이동의 허위-긍정적인 결과 줄 수 있습니다 확산을 최소화 하기 위해 사용 되었습니다. 일부 메서드는 혈 청 기아 스크래치14 이전 및 감소 하는 혈 청15의 양을 보고. 그러나,이 방법의 어느 쪽도 아니 확산은 보장할 수 있습니다. 따라서, 우리는 마이그레이션의 진정한 결과 미토마이신 C와 셀의 전처리를 보고 합니다. 미토마이신 C16분리에서 DNA를 방지 DNA와 공유 결합을 형성 하 여 DNA 합성을 억제 하는 항생제 이다. 미토마이신 C와 미리 치료 하 여 긁 기 전에 PBS로 세척 간격의 감지 된 폐쇄 세포 (그림 1)의 진정한 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.
모든 방법의 특성은 마이그레이션17의 프로세스를 분석 하는 시스템에 대 한 필요 이다. 일반적인 진행 상황을 분석 하는 싼 방법 빛 필드 현미경 이미지 소프트웨어18,19에 간격의 폐쇄의 분석 이어서 미리 정해진된 시간 지점에서 스크래치의 이미지를 사용 하 여 것입니다. 이 방법은 시간이 많이 걸리는, 같은 자리에서 초점, 사진 촬영에 관해서 신뢰할 수 없는 고 사진을 촬영 하는 동안 카메라를 인큐베이터에서 운동 사이클의 온도 변화를 강제로 합니다. 다른 방법은 마이그레이션 전류 흐름을 측정 하 여 검출 하기 위하여 개발 되었습니다. 현재 변경 셀 임피던스20증가 읽기는 접시에 더 많은 공간을 커버. 임피던스를 측정 하 여 세포의 환경 영향을 받지 않습니다, 그리고 방법을 따라서 비-침략 적으로 간주 됩니다. 이 방법은 비싸다, 골드 전극 전문된 접시에 의존 하지만 그들은 세포 부착, 확산, 마이그레이션, 세포 죽음 등 많은 프로세스 검색 사용. 이 방법의 큰 단점은 임피던스에 큰 영향을 미칠 온도 등의 요인으로 임피던스 측정 직접 마이그레이션, 표시 하지 않습니다 것입니다. 임피던스의 변화는 데이터의 분석을 더 어렵게 만드는 소프트웨어에 의해 검토 되지 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 따라서, 시각화의 마이그레이션을 확인 하려면 기존의 가벼운 현미경이 필요 합니다.
많은 사용 가능한 기술의 단점을 극복 하기 위해 우리는 실시간 자동된 광학 카메라를 사용 합니다. 광학 카메라는 렌즈, 조명 장치, 그리고 디지털 카메라와 함께 작은 플랫폼에서 높은 처리량 현미경 탐지 시스템입니다. 그것은 내장 소프트웨어를 마이그레이션 및 다른 것 들 사이에서 확산을 테스트할 수 있습니다. 마이그레이션 감지, 두 알고리즘은 성장과 확산 및 각각 분석, 치유 하는 상처 라고 하는 셀의 마이그레이션 활동을 분석 하는 데 사용 됩니다. 확산 분석은 적용 되는 텍스처 분석 셀 적용 영역 (노란색에서 표시) 간의 차이 감지 하는 2 단계 이미지 세분화 알고리즘에 따라 및 빈 고급 히스토그램 분석 영역 배경. 상처 치유 분석 셀 단층을 감지 하 고, 상처 간격을 찾습니다 하 고 간격 너비를 결정 하는 3 단계 알고리즘을 기반으로 합니다. 다음이 단계는 사용자가 지정한 시간-점에서 실시 하 고 데이터 적용된 지역, 간격 폭 및 간격 영역으로 제공 됩니다. 이 컴퓨터의 큰 장점 중 하나 이다 그 액체를 통해 부착 세포 이미징 카메라21의 각도 때문에. 하나의 z-비행기의 z 스택 예상 카메라 lenstakes 기울이면 이미지 사진 초점 (그림 2)을 생성 합니다. z-스택 상처 가장자리에 그리고 전체 상처에 걸쳐 수직 촬영 사진 (예: 40)의 시리즈를 병합 하 여 생성 됩니다. Z-스택 셀 계층에 초점 비행기의 깊이의 상처에서 캡처 수 있습니다. 또한, 이미지의 시리즈는 버튼의 클릭으로 이미지의 비디오 컬렉션을 함께 넣어 수 있습니다.
마이그레이션 keratinocyte 셀 라인 HaCaT에서의 검색을 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 우리 테스트 Lactoferrin 및 그것의 N 맨끝 펩 티 드, Lactoferricin, 인간과 소,이 분자 항균 및 면역 조절 분자22 수많은 응용 프로그램을가지고 입증 되었습니다 마이그레이션에 미치는 영향 분석에서 , 23. 4 개의 화합물 치료 HaCaT 세포에 비교 했다와 표 피 성장 인자 (EGF) 긍정적인 제어로 사용 되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

셀 이동 건강, 암, 상처 치유 등의 여러 측면에 영향을 미치는 중요 한 프로세스 이며 그것은, 따라서, 마이그레이션 공부 방법 개발을 위한 중요 한. 스크래치 분석 결과 가장 일반적인 생체 외에서 방법 그것의 저가 및 간단한 절차 때문에 안티 프로 migration 속성으로 화합물을 테스트 하. 그러나, 분석 결과의 자주 보고 하는 문제는 처음의 가장자리에 걸쳐 세포의 축적을 이다. 또한, 분석 결과에서 데이터를 얻기 위해 다른 노출의 이미지 이동 해야 시간의 기간 동안 정확한 같은 자리에는 이동의 움직임을 비교 하. 다른 분석 프로그램 스크래치 폐쇄를 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 하지만 그들은 노동 집약, 부정확 한, 및 온도 변화에의 힘 주기. 이 연구에서는 마이그레이션 효과, 예를 들면 자연스럽 게 발생 단백질 인간 및 소 Lactoferrin 및 그들의 N 맨끝 펩 티 드 Lactoferricin HaCaT 상피 세포 선에 대 한 최적화 된 방법을 설명 합니다. 중요 한 최적화는 세척 하 고 가장자리를 따라 셀의 상기 축적을 제거 하는 PBS에 스크래치 이다. 이 keratinocyte-셀 연결에 영향을 보여왔다 양이온의 제거에 의해 설명 될 수 있습니다. 이동의 진정한 검출을 보장 하기 위해, 미리 미토마이신 C, DNA 합성 억제제로 치료 프로토콜에 추가 되었습니다. 마지막으로, 우리는 재현성에 개선 하 고 시간이 지남에 스크래치의 동일한 섹션의 분석을 보장 하면서 자동된 광학 카메라, 과도 한 온도 사이클 제거 스크래치 폐쇄 분석, 육체 노동 방법을 보여 줍니다.

HaCaT은 keratinocyte 셀 라인, 피부에서 가장 풍부한 셀 형식 중 하나입니다. 상처 발생, 피부 세포 증식 및 상처 침대를 닫습니다 (그림 3) 상처를 통해 마이그레이션 시작 합니다. 두 프로세스는, 그러므로, 적절 한 치료에 매우 중요.
광학 카메라는 실시간으로 두 프로세스를 따를 수 있습니다. 마이그레이션,...

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Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.9K 조회수.  Roskilde University. 여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

비디오: Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

작은 하트의 세미 - 자동 광학 도면 분석

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

연구

생물학

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

체외에서 FluoroBlok 종양의 침략 분석

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae has made it a pre-eminent genetic model organism. However, since efficient protein isolation depends upon optimal disruption of cells, the use of yeast for biochemical analysis of cellular proteins is hampered by its cell wall which is expensive to digest enzymatically (using lyticase or zymolyase), and difficult to disrupt mechanically (using a traditional bead beater, a French press or a coffee grinder) without causing heating of samples, which in turn causes protein denaturation and degradation. Although manual grinding of yeast cells under liquid nitrogen (LN2) using a mortar and pestle avoids overheating of samples, it is labor intensive and subject to variability in cell lysis between operators. For many years, we have been successfully preparing high quality yeast extracts using cryogrinding of cells in an automated freezer mill. The temperature of -196 &#176;C achieved with the use of LN2 protects the biological material from degradation by proteases and nucleases, allowing the retrieval of intact proteins, nucleic acids and other macromolecules. Here we describe this technique in detail for budding yeast cells which involves first freezing a suspension of cells in a lysis buffer through its dropwise addition into LN2 to generate frozen droplets of cells known as "popcorn". This popcorn is then pulverized under LN2 in a freezer mill to generate a frozen "powdered" extract which is thawed slowly and clarified by centrifugation to remove insoluble debris. The resulting extracts are ready for downstream applications, such as protein or nucleic acid purification, proteomic analyses, or co-immunoprecipitation studies. This technique is widely applicable for cell extract preparation from a variety of microorganisms, plant and animal tissues, marine specimens including corals, as well as isolating DNA/RNA from forensic and permafrost fossil specimens.

We describe a reliable method for the preparation of whole cell extracts from yeast or other cells using a cryogenic freezer mill that minimizes degradation and denaturation of proteins. The cell extracts are suitable for purification of functional protein complexes, proteomic analyses, co-immunoprecipitation studies and detection of labile protein modifications.

자동 냉동고 밀에서 냉동 분쇄에 의한 세포 추출물 준비

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as development and mounting an immune response. When a defect or alteration occurs with the cell migration process, it can have detrimental outcomes (i.e., cancer metastasis, wound healing, and scar formation). Due to the importance of cell migration, it is necessary to have access to a cell migration assay that is affordable, adaptable, and repeatable. Utilizing the common scratch migration assay, we have developed a new approach to analyzing cell migration that uses general laboratory equipment. The method described uses visual markers that allow for recapturing specific areas of interest without the use of time-lapse microscopy. In addition, it provides flexibility in the experimental design, ranging from altering the migration matrix substrate to the addition of pharmacological modifiers. Furthermore, this protocol outlines a way to account for the area of cell migration, which is not considered by several methods when examining cell migration. This new approach offers a scratch migration assay to a larger audience and will provide greater opportunity for researchers to examine the physiological and pathophysiological impact of cell migration.

We present a cost-effective method to the scratch migration assay that provides a new approach for determining cell migration without the use of equipment-intensive methods. While fibroblasts were used in this protocol, it can be adapted and utilized to study additional cell types and influences on cell migration.

비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

요약

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